Kết quả 1 đến 10 của 10

Chủ đề: Các nguyên lý và phương pháp xét nghiệm hiv

  1. #1
    Admin diendanhiv.vn
    ( Sanh năm 1971 )
    Tuanmecsedec's Avatar
    Ngày tham gia
    29-08-2007
    Giới tính
    Nam
    Đến từ
    Giấy chứng nhận tham vấn số : 041/UB AIDS - TV do ủy ban phòng chống HIV/AIDS TPHCM.
    Bài viết
    74,838
    Cảm ơn
    3,481
    Được cảm ơn: 18,160 lần

    Các nguyên lý và phương pháp xét nghiệm hiv

    ÁP DỤNG CHIẾN LƯỢC 3 XÉT NGHIỆM TRONG SÀNG LỌC BỆNH NHÂN NHIỄM HIV TẠI BỆNH VIỆN TWQĐ 108


    TS Lê Văn Don và CS
    Bệnh viện TWQĐ 108


    Từ năm 1996 chúng tôi đã áp dụng chiến lược 3 xét nghiệm trong chẩn đoán nhiễm HIV. Các xét nghiệm sau đây đã được thực hiện tại viện 108:
    - Xét nghiệm ELISA 1 (BIO-RAD) với các kháng nguyên gp160, p25, gp36
    - Xét nghiệm ELISA 2 (SD) với các kháng nguyên gp 41, p24, gp36
    - Xét nghiệm ELISA 3 (Abbott) với kháng nguyên peptide tổng hợp của virus HIV1, HIV2 nhóm O và M, conjugate gắn với các kháng thể kháng p24, p26.
    - Xét nghiệm serodia SFD (Fujirebio) với các kháng nguyên gp41, p24, gp36
    - Xét nghiệm nhanh Determine HIV1 /2 với các kháng nguyên của HIV1 (gp41), HIV2 (gp36), conjugate là các kháng thể kháng HIV1, HIV2 gắn selenium colloid.
    Các chiến lược đã áp dụng:
    - ELISA 1 + SERODIA + Determine HIV1/2
    - ELISA 1 + ELISA 2 + Determine HIV1/2
    - ELISA 1 + ELISA 3 + Determine HIV1/2
    Từ năm 1996 đến nay, chúng tôi đã xét nghiệm sàng lọc 63948 bệnh nhân, trong đó có 547 bệnh nhân dương tính (tỷ lệ dương tính chung là 0t,85%, tỷ lệ HIV dương tính từ năm 2000 đến nay là 1,062%) bằng chiến lược 3 xét nghiệm.
    So sánh với Western Blot: mức độ phù hợp 17/17.
    Uu điểm:
    - Độ nhạy cao
    - Độ đặc hiệu cao
    - Đơn giản
    - Rẻ tiền
    - Kết quả nhanh
    Nhược điểm:
    - Không xác định được HIV1 và HIV2
    - Không có khả năng định typ, không đánh giá được gánh nặng virus
    Trong điều kiện hiện nay đối với các cơ sở y tế thực hành lâm sàng, chiến lược 3 xét nghiệm vẫn là một chiến lược tốt, nên áp dụng.









    APPLICATION OF STRATEGY USING 3 TESTS IN SCREENING
    OF PATIENTS WITH HIV POSITIVE AT CENTRAL MILITARY HOSPITAL 108

    Le Van Don, MD, PhD et al
    Central Military Hospital 108

    Since 1996, strategy using 3 tests in screening of patients with HIV positive was applied in hospital 108 and following assays were used:
    - ELISA 1 Technique (BIO-RAD) for detection of HIV antigen gp160, p25, gp36
    - ELISA 2 Technique (SD) for detection of HIV antigen gp 41, p24, gp36
    - ELISA 3 Technique (Abbott): plates coated with HIV antigens synthetic peptide of HIV1/2 group O and M, conjugate containing monoclonal antibodies to p24, p26.
    - Serodia SFD Technique (Fujirebio) for detection of HIV antigen gp41, p24, gp36
    - Fast Test Technique (Determine HIV1/2) for detection of HIV antigen HIV1 (gp41), HIV2 (gp36), conjugate containing monoclonal antibodies to HIV1, HIV2 binding to selenium colloid.
    Since 1996 up to now, total of 63948 patients were screened and 547 patients were reactive with HIV ( rate of HIV positive was 0.85%, from 2000 up to now this rate was 1.062%) using 3 test trategy.
    Comparison with Western Blot: suitable 17/17.
    Advantage:
    - High sensitivity
    - High specificity
    - Simple procedure
    - Inexpensive
    - Fast
    Disadvantage

    - Can not detect HIV1 and HIV2
    - Can not detect type, subtype and viral load of HIV1/2
    Strategy using 3 tests in screening of patients with HIV positive was good strategy and this strategy should be applied for clinical practice.





    ads

  2. Những thành viên đã cảm ơn Tuanmecsedec cho bài viết này:

    xindoi1_cohoi (11-10-2013)

  3. #2
    Admin diendanhiv.vn
    ( Sanh năm 1971 )
    Tuanmecsedec's Avatar
    Ngày tham gia
    29-08-2007
    Giới tính
    Nam
    Đến từ
    Giấy chứng nhận tham vấn số : 041/UB AIDS - TV do ủy ban phòng chống HIV/AIDS TPHCM.
    Bài viết
    74,838
    Cảm ơn
    3,481
    Được cảm ơn: 18,160 lần
    CÁC NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM HIV




    1. Đại cương:
    1.1. Cấu trúc của virus HIV.

    CẤU TRÚC CỦA VIRUS HIV

    HIV có đặc điểm chung của họ retroviridae. Hạt virus hoàn chỉnh (virion) có cấu trúc gồm 3lớp.
    1.1.1. Lớp vỏ ngoài (vỏ peplon): lớp này là 1 màng lipid kép có kháng nguyên chéo với màng nguyên sinh chất tế bào. Gắn lên màng này là các nhú. Đó là các phân tử Glycoprotein có trọng lượng phân tử 160 kilodalton (gp160). Nó gồm có 2 phần:
    + Glycoprotein màng ngoài có trọng lượng phân töû là 120 kilodalton (gp120). GP120 là kháng nguyên đã biến đổi nhất, gây khó khăn cho phản ứng bảo vệ cơ thể và chế vaccin phòng bệnh.
    + Glycoprotein: xuyên màng có trọng lượng phân töû 41 kilodalton.
    1.1.2. Vỏ trong (vỏ capsid): vỏ này gồm 2 lớp protein:
    + Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi protein có trọng lượng phân töû 18 kilodalton (p18).
    + Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi các phân tử có trọng lượng phân tử là 24 kilodalton (p24). Đây là kháng nguyên rất quang trọng để chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS.
    1.1.3. Lõi:
    Là những thành phần bên trong của vỏ capsid, bao gồm:
    + Hai phân tử ARN đơn, đó là bộ gen di truyền HIV(genom).
    Genom của HIV chứa 3 gen cấu trúc: Gag (group specific antigen) là cac gen mã hoá cho các kháng nguyên đặc hiệu của capsid cuûa virus; Pol (polymerase) mã hoá cho các Enzym: reverve transcriptase (RT:Enzym sao mã ngược), protease và endonuclease (còn gọi kháng nguyên integrase); và EnV (envelop) mã hoá cho glycoprotein lớp vỏ peplon của HIV.
    1.2. Sự xâm nhập vào tế bào và nhân lên của virus HIV.

    1.2.1. Sự hấp phụ lên bề mặt tế bào.
    HIV bám vào bề mặt tế bào cảm thụ nhờ sự phù hợp giữa Receptor tế bào với GP120 của nó. Trong đa số các trường hợp, các receptor này là các phân tử CD4 của lympho T hỗ trợ hoặc một soá tế bào khác như bạch cầu đơn nhân lớn, đại thực bào và 1 số tế bào doøng lympho.
    1.2.2. Sự xâm nhập vào tế bào:
    Sau khi đã bám vào các receptor của tế bào vật chủ , phân tử gp41 của HIV cắm sâu vào màng tế bào. Nhờ đó genom của HIV chui vào bên trong của tế bào. Vì vậy giai đoạn này còn gọi là ‘cắm neo và hoà màng’.
    1.2.3. Sự nhân lên trong tế bào:
    1.2.3.1. Sao mã sớm: nhờ RT, ADN bổ sung của HIV đã được tạo thành (đã được tạo thành) từ khuôn mẫu ARN của nó. Lúc đầu là sản phẩm lai ARN_ADN, sau đó nhờ Enzym ARN_ase tách ARN khỏi ADN và sợi ADN bổ sung mới được tổng hợp, tạo thành phân tử ADN chuỗi kép.
    1.2.3.2. Tích hợp.
    Sau khi tổng hợp ADN kép tạo thành dạng vòng khép kín và chui vào nhân tế bào chủ. Sau đó nó tích hợp vào ADN nhờ integrase .
    Nhờ tích hợp, HIV đã tránh được sự bảo vệ cơ thể, tác dụng của thuốc và gây bệnh chậm.
    Sau khi tích hợp, AND của HIV có toàn tại ở một trong 2 trạng thái:
    - Không hoạt động và nằm im như tiền virus. Trạng thái tiềm tàng này có thể trở thành hoạt động như những virus độc lực dưới các tác động của môi trường.
    - ADN bổ sung của HIV được sao chép thành hạt virion mới. Ñây là trạng thái nhân lên của HIV với các bước tiếp theo như sau:
    1.2.3.3. Sao mã muộn:
    ADN boå sung của HIV được sao mã thành ARN genom và ARN thoâng tin cho nó (mARN)
    1.2.3.4. Dịch mã:
    Nhờ mARN được tạo thành ở giai đoạn trên, các prrotein cần của HIV được toång hợp.
    1.2.3.5. Lắp ráp các hạt virion mới:
    Từ các thành phần đã được toång hợp, các hạt HIV mới được lắp ráp ở bào tương tế bào.
    1.2.3.6. Giải phóng các hạt HIV mới:
    Từ các vị trí lắp ráp các hạt HIV gần màng nguyên sinh chất, các màng này nảy chồi và các hạt HIV được giải phóng. Chúng tiếp tục gây nhiễm cho tế bào mới, còn tế bào đã giúp chúng nhân lên thì bị diệt.
    2. Mịc tiêu xét nghiệm HIV.
    2.1. Giám sát HIV/AIDS.
    2.2. An toàn truyền máu.
    2.3. Chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS.
    2.4. Nghiên cứu khoa học.
    3. Các phương cách xét nghiệm HIV.
    3.1. Phương cách 1 . (áp dụng cho công tác an toàn truyền máu):
    Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách I khi mẫu đó dương tính với một trong các thử nghiệm như: ELISA, Serodia hay thử nghiệm nhanh.
    Trong truyền máu, mẫu máu được xét nghiệm với phương cách I nếu dương tính hay nghi ngờ đều phải loại bỏ.
    3.2. Phương cách II: (áp dụng cho giám sát trọng điểm):
    Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách II khi mẫu đó dương tính cả hai lần xét nghiệm bằng hai loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.
    3.3. Phương cách III: (chẩn đoán nhiễm HIV).
    Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách III khi mẫu đó dương tính cả ba lần xét nghiệm bằng ba loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.
    4. Các nguyên lý và phương pháp xét nghiệm HIV.
    4.1. Phương pháp gián tiếp:
    Phát hiện kháng thể kháng HIV trong máu, dịch tiết.
    Áp dụng:
    - Giám sát dịch tễ.
    - Chẩn đoán nhiễm HIV trên 18 tháng tuổi.
    Các kỹ thuật tìm kháng thể được chia thành 2 loại:
    * Các xét nghiệm phát hiện sàng lọc: cần có độ nhạy cao.
    * Các xét nghiệm khẳng định: cần độ đặc hiệu cao.
    4.1.1. Xét nghiệm phát hiện sàng lọc.
    Các kỹ thuật: ELISA, các thử nghiệm nhanh có độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau. Phối hợp các kỹ thuật khác nhau trong các phương cách xét nghiệm phải tuân theo nguyên tắc:
    * Thử nghiệm đầu tiên có độ nhạy cao.
    * Các thử nghiệm tiếp theo có nguyên lý hoặc cách chuẩn bị KN khác nhau và cần có độ đặc hiệu cao.
    4.1.1.1. Thử nghiệm miễn dịch gắn men – Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
    * Nguyên lý chung:
    - Kháng nguyên (Ag) virus cố định trên phiến nhựa.
    - Kháng thể (Ab) kháng HIV của bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với Ag.
    - Phức hợp Ag-Ab được phát hiện bởi hệ thống cộng hợp gắn enzyme và cho phản ứng hiện màu với cơ chất tương ứng.
    4.1.1.1.1. ELISA gin tiếp: Độ nhạy cao huyết thanh cần thử ủ với bản nhựa đã gắn kháng nguyên, sau khi rửa để loại kháng thể thừa, không đặc hiệu, lại tiếp tục ủ với kháng thể kháng globulinngười gắn Enzym. Hoạt tính Enzym sẽ biến cơ chất không màu thành một sản phẩm có màu. Phản ứng màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường và đọc chính xác bằng quang kế.

    Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể

    4.1.1.1.2. ELISA sandwich: độ đặc hiệu và độ nhạy cao.
    Cũng tương tự kỷ thuật ELISA gián tiếp chỉ khác là kháng nguyên virus có gắn Enzym được thay kháng thể globlin người gắn enzym. Như vậy hình thành 1 Sandwich của phức hợp KN_KT_KN_Enzym. Sự thay đổi này làm tăng độ nhạy và đô đặc hiệu của phản ứng, nó cũng cho cho phép phát hiện tất cả các lớp kháng thể vì không dùng Anti IgG người gắn Enzym.

    4.1.1.1.3. ELISA cạnh tranh: Độ nhạy cao.
    Nguyên lý phản ứng tương tự như hai loại trên song chỉ khác là huyết thanh của mẫu thử có KT kháng HIV ủ cùng với kháng thể kháng HIV có gắn Enzym. Như vậy có sự tranh chấp giữa hai loại kháng thể trong phản ứng kết hợp với KN-KT đã gắn vào pha rắn, Đậm độ KT trong mẫu thử càng cao thì KT càng ít được cố định vào KN . Cơ chất sẽ cho 1 phản ứng màu tỉ lệ nghịch với đâm đô KT của màu phải thử.

    ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH GẮN MEN – ELISA.
    * Ưu điểm:
    - Thực hiện đồng thời được nhiều mẫu.
    - Đọc kết quả bằng máy không phụ thuộc vào chủ quan của con người.
    - Có thể lưu kết quả, thuận lợi cho kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm.
    - Giá thành tương đối rẻ.
    * Hạn chế:
    - Phải đầu tư trang thiết bị ban đầu và bảo dưỡng máy.
    - Sinh phẩm phải bảo quản lạnh.
    - Nhân viên xét nghiệm phải được đào tạo.
    - Thời gian thực hiện: 3 – 4 giờ.
    - Nếu số lượng mẫu ít thì tốn kém vì phải làm nhiều chứng.
    4.1.1.2. Các thử nghiệm nhanh.
    4.1.1.2.1. Thử nghiệm ngưng kết hạt Serodia:
    - Nguyên lý:
    Những hạt gelatin được gắn với các thành phần KN của virus HIV sẽ tạo ngưng kết khi trong huyết thanh (hoặc huyết tương) bệnh nhân có KT kháng HIV.
    - Kháng nguyên được gắn trên hạt gelatin:
    HIV 1 gp41 protein tái tổ hợp.
    HIV 1 p24 protein tái tổ hợp.
    HIV2 gp36 protein tái tổ hợp.

    4.1.1.2.2. Các thử nghiệm nhanh:
    - Kit Determine HIV1/2: dựa trên nguyên lý miễn dịch sắc ký. (Thường sử dụng để kiểm tra HIV gấp và luôn phải được kiểm chứng bằng kỹ thuật khác)
    - Kit Multispot HIV1/2: là phương pháp miễn dịch trên màng lọc, dựa trên nguyên lý ELISA (Phân biệt được HIV1 và HIV2).

    * Ưu điểm:
    - Xét nghiệm với số lượng mẫu nhỏ.
    - Dễ thực hiện, cho kết quả nhanh.
    - Không đòi hỏi thiết bị đặc biệt, sinh phẩm dễ bảo quản.
    - Có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở.
    - Xét nghiệm viên có thể được đào tạo nhanh.
    * Nhược điểm:
    - Giá thành cao.
    - Không thuận lợi khi xét nghiệm số mẫu lớn.
    - Không lưu được dữ liệu kỹ thuật.
    - Một số test nhanh có độ nhạy kém hơn so với ELISA.
    4.1.2. Xét nghiệm khẳng định.
    Western blot (Kit New Lab blot I ):
    4.1.2.1. Nguyên lý:
    - Protein Virus HIV được tách theo PM bằng điện di trên gel polyacrylamid.
    - Chuyển sang giấy nitrocellulose, các protein định vị theo PM.
    - KT kháng HIV trong mẫu thử kết hợp đặc hiệu với KN tương ứng.
    - Phát hiện phức hợp KN-KT bằng cộng hợp KT kháng IgG gắn men, cho phản ứng màu với cơ chất tại các vị trí có KT đặc hiệu với KN tương ứng. Western blot có độ nhạy và độ đặc hiệu cao; song giá thành cao và đòi hỏi người xét nghiệm phải có trình độ và kinh nghiệm.
    4.1.2.2. Biện luận kết quả.
    * WB âm tính: không có băng nào
    * WB dương tính: có ít nhất 2 băng tương ứng với proteine vỏ:
    HIV 1: gp 160, gp 120, gp 41
    HIV 2: gp 140, gp 125, gp 36 ngoài ra có các băng tương ứng với sản phẩm của gen gag/pol.
    * WB chưa xác định : có băng ở vị trí khác tiêu chuẩn WB dương tính.
    4.2. Phương pháp trực tiếp:
    Phát hiện trực tiếp: KN virus, axit nucleic hoặcVirus.
    Áp dụng:
    - Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV.
    - Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện KT không rõ ràng.
    - Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virút và trong các mục đích nghiên cứu khác.
    4.2.1. Phân lập virus bằng nuôi cấy tế bào.
    Nguyên lý:
    - Tách tế bào đơn nhân trong máu bệnh nhân và nuôi cấy chung với tế bào đơn nhân của người lành đã được hoạt hóa trong môi trường nuôi cấy PHA (phytohemagglutinin) thích hợp.
    - Xác định sự nhân lên của virus bằng kỹ thuật:
    * ELISA phát hiện KN p24 trong nước nổi môi trường nuôi cấy tế bào.
    * Dùng đồng vị phóng xạ phát hiện enzyme sao chép ngược của virus (RT).
    4.2.2. Phát hiện các axit nucleic (RNA) của virus hoặc DNA (provirut) trong tế bào nhiễm.
    * RNA của virus HIV bằng kỹ thuật RT-PCR:
    · RNA enzyme sao chép ngược và mồi cDNA
    · Quá trình PCR là chuỗi nhiều chu kỳ kế tiếp nhau.
    Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
    - Bước 1: biến tính tách rời 2 chuỗi của phân tử DNA đích ở nhiệt độ 940 – 950.
    - Bước 2: bắt cặp, các cặp mồi đặc hiệu cho một trình tự DNA xác định bắt cặp với sợi DNA đích ở nhiệt độ 400 -700.
    - Bước 3: tổng hợp, kéo dài. Ở nhiệt độ 720, Taq polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA có trình tự bổ sung cho sợi khuôn.
    - Trong chẩn đoán nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh, ngoài RT- PCR còn dùng PCR phát hiện các DNA provirút trong tế bào nhiễm.
    - PCR được thực hiện trên 3 vùng gen: env, gag và pol.
    - Kết quả được trả lời dương tính khi có PCR dương tính ít nhất là trên hai trong ba gen và được thực hiện trên hai mẫu máu ở thời điểm khác nhau.
    * Ưu điểm: có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh chóng.
    * Hạn chế: phải có cơ sở phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn và trang thiết bị đắt tiền. Cán bộ cần đào tạo tốt.
    4.2.3. Phát hiện KN p24 của virus trong máu
    - p24 l một chỉ số trực tiếp phản ánh sự nhân lên của virut
    - Được phát hiện sớm trong giai đoạn mới nhiễm.
    - Giảm khi có KT kháng p24.
    - Gia tăng khi chuyển sang giai đoạn AIDS
    Kit phát hiện p24: ELISA sandwich.
    * Nguyên lý:
    KT đơn dòng kháng với KN p24 được gắn sẵn trong các giếng, nếu mẫu thử có KN p24 sẽ gắn với KT này và được phát hiện bằng cộng hợp (KT đa dòng kháng HIV) gắn men cho phản ứng màu với cơ chất.

    4.3. Lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm HIV.
    4.3.1. Sự biến động của các thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm HIV chưa điều trị.
    - Kháng nguyên HIV đặc hiệu KNp24 xuất hiện sớm, một thời gian ngắn sau nhiễm HIV và duy trì trong suốt thời gian cấp (sớm) của nhiễm HIV. Sau đó KNp24 giảm dần đồng thời có sự xuất hiện KTp24. Điều này báo hiệu giai đoạn không triệu chứng của nhiễm HIV.
    - Vài tháng tới vài năm sau nhiễm trùng, KTp24 mất đi v KNp24 tái xuất hiện, báo giai đoạn triệu chứng của bệnh. Sự nhân lên của HIV tương ứng với sự có mặt của KNp24.
    - Kháng thể HIV: Trước tiên kháng thể HIV lớp IgM xuất hiện, sau đó giảm dần và thay vào đó là KT lớp IgG. IgG khng p24 xuất hiện và giảm dần cùng với sự mất đi và xuất hiện lại KN HIV. Trong khi đó IgG kháng KN vỏ của HIV tồn tại lâu dài trong suốt thời gian bị nhiễm.
    4.3.2. Lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm HIV
    4.3.2.1. Nguyên tắc chung.
    - Mục đích xét nghiệm.
    - Thời điểm phơi nhiễm.
    - Đối tượng xét nghiệm.
    - Tỷ lệ nhiễm trong quần thể.
    - Thời gian cần trả lời kết quả.
    - Điều kiện cụ thể của phòng thí nghiệm.
    - Tư vấn trước xét nghiệm.
    4.3.2.2. Lựa chọn cụ thể
    4.3.2.2.1. Giai đoạn ủ bệnh:" giai đoạn cửa sổ sinh học". Giai đoạn này từ khi nhiễm HIV 1 tuần lễ: một số kỹ thuật có thể giúp ích chẩn đoán như:
    - Phân lập virus.
    - PCR.
    - Phát hiện kháng nguyên p24.
    - Phát hiện kháng thể Ig (kỹ thuật ELISA sandwich)
    4.3.2.2.2. Giai đoạn có kháng thể
    Kỹ thuật:
    - Serodia.
    - ELISA.
    - Test nhanh.
    - Western blot.
    4.3.3. Nhận định kết quả.
    4.3.3.1. Các phương pháp trực tiếp:
    - Dương tính: kết luận dương tính.
    - Âm tính: kết luận âm tính.
    4.3.3.2. Các phương pháp xét nghiệm gián tiếp:
    - Mẫu thử nghiệm âm tính lần đầu: kết luận âm tính.
    - Để khẳng định mẫu HIV dương tính: Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với khi mẫu đó dương tính cả ba lần xét nghiệm bằng ba loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.
    QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM TẠI PHÒNG HIV BỆNH VIỆN PHONG - DA LIỄU TRUNG ƯƠNG QUY HOÀ
    5. Kết luận: Để kết luận tình trạng mẫu thử là dương tính khi:
    5.1. Tính hợp lệ của thử nghiệm:
    Theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất sinh phẩm.
    5.2. Chỉ thực hiện tại các phòng thí nghiệm HIV được phép khẳng định HIV dương tính.
    5.3. Theo đúng hướng dẫn sử dụng sinh phẩm và đúng phương cách xét nghiệm.
    5.4. Nếu kết quả giữa các thử nghiệm không phù hợp, hẹn 3 tháng sau lấy mẫu xét nghiệm lại.

    Tài liệu tham khảo
    1. Phạm nhật An và cs (1995), Nhiễm HIV/AIDS y học cơ sở, lâm sàng và phòng chống, NXBY học, Hà nội, 26-51.
    2. Trần chí Liêm và CS (11-2001), xét nghiệm chẩn đoán HIV, Hà nội, 4-28.
    3. Trương xuân Liên, tài liệu tập huấn tại viên Pasteur TPHCM

  4. #3
    Admin diendanhiv.vn
    ( Sanh năm 1971 )
    Tuanmecsedec's Avatar
    Ngày tham gia
    29-08-2007
    Giới tính
    Nam
    Đến từ
    Giấy chứng nhận tham vấn số : 041/UB AIDS - TV do ủy ban phòng chống HIV/AIDS TPHCM.
    Bài viết
    74,838
    Cảm ơn
    3,481
    Được cảm ơn: 18,160 lần

    Các nguyên lý và phương pháp xét nghiệm hiv

    CÁC NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM HIV


    1. Đại cương:
    1.1. Cấu trúc của virus HIV.

    CẤU TRÚC CỦA VIRUS HIV

    HIV có đặc điểm chung của họ retroviridae. Hạt virus hoàn chỉnh (virion) có cấu trúc gồm 3lớp.
    1.1.1. Lớp vỏ ngoài (vỏ peplon): lớp này là 1 màng lipid kép có kháng nguyên chéo với màng nguyên sinh chất tế bào. Gắn lên màng này là các nhú. Đó là các phân tử Glycoprotein có trọng lượng phân tử 160 kilodalton (gp160). Nó gồm có 2 phần:
    + Glycoprotein màng ngoài có trọng lượng phân töû là 120 kilodalton (gp120). GP120 là kháng nguyên đã biến đổi nhất, gây khó khăn cho phản ứng bảo vệ cơ thể và chế vaccin phòng bệnh.
    + Glycoprotein: xuyên màng có trọng lượng phân töû 41 kilodalton.
    1.1.2. Vỏ trong (vỏ capsid): vỏ này gồm 2 lớp protein:
    + Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi protein có trọng lượng phân töû 18 kilodalton (p18).
    + Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi các phân tử có trọng lượng phân tử là 24 kilodalton (p24). Đây là kháng nguyên rất quang trọng để chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS.
    1.1.3. Lõi:
    Là những thành phần bên trong của vỏ capsid, bao gồm:
    + Hai phân tử ARN đơn, đó là bộ gen di truyền HIV(genom).
    Genom của HIV chứa 3 gen cấu trúc: Gag (group specific antigen) là cac gen mã hoá cho các kháng nguyên đặc hiệu của capsid cuûa virus; Pol (polymerase) mã hoá cho các Enzym: reverve transcriptase (RT:Enzym sao mã ngược), protease và endonuclease (còn gọi kháng nguyên integrase); và EnV (envelop) mã hoá cho glycoprotein lớp vỏ peplon của HIV.
    1.2. Sự xâm nhập vào tế bào và nhân lên của virus HIV.

    1.2.1. Sự hấp phụ lên bề mặt tế bào.
    HIV bám vào bề mặt tế bào cảm thụ nhờ sự phù hợp giữa Receptor tế bào với GP120 của nó. Trong đa số các trường hợp, các receptor này là các phân tử CD4 của lympho T hỗ trợ hoặc một soá tế bào khác như bạch cầu đơn nhân lớn, đại thực bào và 1 số tế bào doønglympho.
    1.2.2. Sự xâm nhập vào tế bào:
    Sau khi đã bám vào các receptor của tế bào vật chủ , phân tử gp41 của HIV cắm sâu vào màng tế bào. Nhờ đó genom của HIV chui vào bên trong của tế bào. Vì vậy giai đoạn này còn gọi là ‘cắm neo và hoà màng’.
    1.2.3. Sự nhân lên trong tế bào:
    1.2.3.1. Sao mã sớm: nhờ RT, ADN bổ sung của HIV đã được tạo thành (đã được tạo thành) từ khuôn mẫu ARN của nó. Lúc đầu là sản phẩm lai ARN_ADN, sau đó nhờ Enzym ARN_ase tách ARN khỏi ADN và sợi ADN bổ sung mới được tổng hợp, tạo thành phân tử ADN chuỗi kép.
    1.2.3.2. Tích hợp.
    Sau khi tổng hợp ADN kép tạo thành dạng vòng khép kín và chui vào nhân tế bào chủ. Sau đó nó tích hợp vào ADN nhờ integrase .
    Nhờ tích hợp, HIV đã tránh được sự bảo vệ cơ thể, tác dụng của thuốc và gây bệnh chậm.
    Sau khi tích hợp, AND của HIV có toàn tại ở một trong 2 trạng thái:
    - Không hoạt động và nằm im như tiền virus. Trạng thái tiềm tàng này có thể trở thành hoạt động như những virus độc lực dưới các tác động của môi trường.
    - ADN bổ sung của HIV được sao chép thành hạt virion mới. Ñây là trạng thái nhân lên của HIV với các bước tiếp theo như sau:
    1.2.3.3. Sao mã muộn:
    ADN boå sung của HIV được sao mã thành ARN genom và ARN thoâng tin cho nó (mARN)
    1.2.3.4. Dịch mã:
    Nhờ mARN được tạo thành ở giai đoạn trên, các prrotein cần của HIV được toång hợp.
    1.2.3.5. Lắp ráp các hạt virion mới:
    Từ các thành phần đã được toång hợp, các hạt HIV mới được lắp ráp ở bào tương tế bào.
    1.2.3.6. Giải phóng các hạt HIV mới:
    Từ các vị trí lắp ráp các hạt HIV gần màng nguyên sinh chất, các màng này nảy chồi và các hạt HIV được giải phóng. Chúng tiếp tục gây nhiễm cho tế bào mới, còn tế bào đã giúp chúng nhân lên thì bị diệt.
    2. Mịc tiêu xét nghiệm HIV.
    2.1. Giám sát HIV/AIDS.
    2.2. An toàn truyền máu.
    2.3. Chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS.
    2.4. Nghiên cứu khoa học.
    3. Các phương cách xét nghiệm HIV.
    3.1. Phương cách 1 . (áp dụng cho công tác an toàn truyền máu):
    Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách I khi mẫu đó dương tính với một trong các thử nghiệm như: ELISA, Serodia hay thử nghiệm nhanh.
    Trong truyền máu, mẫu máu được xét nghiệm với phương cách I nếu dương tính hay nghi ngờ đều phải loại bỏ.
    3.2. Phương cách II: (áp dụng cho giám sát trọng điểm):
    Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách II khi mẫu đó dương tính cả hai lần xét nghiệm bằng hai loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.
    3.3. Phương cách III: (chẩn đoán nhiễm HIV).
    Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách III khi mẫu đó dương tính cả ba lần xét nghiệm bằng ba loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.
    4. Các nguyên lý và phương pháp xét nghiệm HIV.
    4.1. Phương pháp gián tiếp:
    Phát hiện kháng thể kháng HIV trong máu, dịch tiết.
    Áp dụng:
    - Giám sát dịch tễ.
    - Chẩn đoán nhiễm HIV trên 18 tháng tuổi.
    Các kỹ thuật tìm kháng thể được chia thành 2 loại:
    * Các xét nghiệm phát hiện sàng lọc: cần có độ nhạy cao.
    * Các xét nghiệm khẳng định: cần độ đặc hiệu cao.
    4.1.1. Xét nghiệm phát hiện sàng lọc.
    Các kỹ thuật: ELISA, các thử nghiệm nhanh có độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau. Phối hợp các kỹ thuật khác nhau trong các phương cách xét nghiệm phải tuân theo nguyên tắc:
    * Thử nghiệm đầu tiên có độ nhạy cao.
    * Các thử nghiệm tiếp theo có nguyên lý hoặc cách chuẩn bị KN khác nhau và cần có độ đặc hiệu cao.
    4.1.1.1. Thử nghiệm miễn dịch gắn men – Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
    * Nguyên lý chung:
    - Kháng nguyên (Ag) virus cố định trên phiến nhựa.
    - Kháng thể (Ab) kháng HIV của bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với Ag.
    - Phức hợp Ag-Ab được phát hiện bởi hệ thống cộng hợp gắn enzyme và cho phản ứng hiện màu với cơ chất tương ứng.
    4.1.1.1.1. ELISA gin tiếp: Độ nhạy cao huyết thanh cần thử ủ với bản nhựa đã gắn kháng nguyên, sau khi rửa để loại kháng thể thừa, không đặc hiệu, lại tiếp tục ủ với kháng thể kháng globulinngười gắn Enzym. Hoạt tính Enzym sẽ biến cơ chất không màu thành một sản phẩm có màu. Phản ứng màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường và đọc chính xác bằng quang kế.

    Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể

    4.1.1.1.2. ELISA sandwich: độ đặc hiệu và độ nhạy cao.
    Cũng tương tự kỷ thuật ELISA gián tiếp chỉ khác là kháng nguyên virus có gắn Enzym được thay kháng thể globlin người gắn enzym. Như vậy hình thành 1 Sandwich của phức hợp KN_KT_KN_Enzym. Sự thay đổi này làm tăng độ nhạy và đô đặc hiệu của phản ứng, nó cũng cho cho phép phát hiện tất cả các lớp kháng thể vì không dùng Anti IgG người gắn Enzym.

    4.1.1.1.3. ELISA cạnh tranh: Độ nhạy cao.
    Nguyên lý phản ứng tương tự như hai loại trên song chỉ khác là huyết thanh của mẫu thử có KT kháng HIV ủ cùng với kháng thể kháng HIV có gắn Enzym. Như vậy có sự tranh chấp giữa hai loại kháng thể trong phản ứng kết hợp với KN-KT đã gắn vào pha rắn, Đậm độ KT trong mẫu thử càng cao thì KT càng ít được cố định vào KN . Cơ chất sẽ cho 1 phản ứng màu tỉ lệ nghịch với đâm đô KT của màu phải thử.

    ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH GẮN MEN – ELISA.
    * Ưu điểm:
    - Thực hiện đồng thời được nhiều mẫu.
    - Đọc kết quả bằng máy không phụ thuộc vào chủ quan của con người.
    - Có thể lưu kết quả, thuận lợi cho kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm.
    - Giá thành tương đối rẻ.
    * Hạn chế:
    - Phải đầu tư trang thiết bị ban đầu và bảo dưỡng máy.
    - Sinh phẩm phải bảo quản lạnh.
    - Nhân viên xét nghiệm phải được đào tạo.
    - Thời gian thực hiện: 3 – 4 giờ.
    - Nếu số lượng mẫu ít thì tốn kém vì phải làm nhiều chứng.
    4.1.1.2. Các thử nghiệm nhanh.
    4.1.1.2.1. Thử nghiệm ngưng kết hạt Serodia:
    - Nguyên lý:
    Những hạt gelatin được gắn với các thành phần KN của virus HIV sẽ tạo ngưng kết khi trong huyết thanh (hoặc huyết tương) bệnh nhân có KT kháng HIV.
    - Kháng nguyên được gắn trên hạt gelatin:
    HIV 1 gp41 protein tái tổ hợp.
    HIV 1 p24 protein tái tổ hợp.
    HIV2 gp36 protein tái tổ hợp.

    4.1.1.2.2. Các thử nghiệm nhanh:
    - Kit Determine HIV1/2: dựa trên nguyên lý miễn dịch sắc ký. (Thường sử dụng để kiểm tra HIV gấp và luôn phải được kiểm chứng bằng kỹ thuật khác)
    - Kit Multispot HIV1/2: là phương pháp miễn dịch trên màng lọc, dựa trên nguyên lý ELISA (Phân biệt được HIV1 và HIV2).

    * Ưu điểm:
    - Xét nghiệm với số lượng mẫu nhỏ.
    - Dễ thực hiện, cho kết quả nhanh.
    - Không đòi hỏi thiết bị đặc biệt, sinh phẩm dễ bảo quản.
    - Có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở.
    - Xét nghiệm viên có thể được đào tạo nhanh.
    * Nhược điểm:
    - Giá thành cao.
    - Không thuận lợi khi xét nghiệm số mẫu lớn.
    - Không lưu được dữ liệu kỹ thuật.
    - Một số test nhanh có độ nhạy kém hơn so với ELISA.
    4.1.2. Xét nghiệm khẳng định.
    Western blot (Kit New Lab blot I ):
    4.1.2.1. Nguyên lý:
    - Protein Virus HIV được tách theo PM bằng điện di trên gel polyacrylamid.
    - Chuyển sang giấy nitrocellulose, các protein định vị theo PM.
    - KT kháng HIV trong mẫu thử kết hợp đặc hiệu với KN tương ứng.
    - Phát hiện phức hợp KN-KT bằng cộng hợp KT kháng IgG gắn men, cho phản ứng màu với cơ chất tại các vị trí có KT đặc hiệu với KN tương ứng. Western blot có độ nhạy và độ đặc hiệu cao; song giá thành cao và đòi hỏi người xét nghiệm phải có trình độ và kinh nghiệm.
    4.1.2.2. Biện luận kết quả.
    * WB âm tính: không có băng nào
    * WB dương tính: có ít nhất 2 băng tương ứng với proteine vỏ:
    HIV 1: gp 160, gp 120, gp 41
    HIV 2: gp 140, gp 125, gp 36 ngoài ra có các băng tương ứng với sản phẩm của gen gag/pol.
    * WB chưa xác định : có băng ở vị trí khác tiêu chuẩn WB dương tính.
    4.2. Phương pháp trực tiếp:
    Phát hiện trực tiếp: KN virus, axit nucleic hoặcVirus.
    Áp dụng:
    - Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV.
    - Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện KT không rõ ràng.
    - Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virút và trong các mục đích nghiên cứu khác.
    4.2.1. Phân lập virus bằng nuôi cấy tế bào.
    Nguyên lý:
    - Tách tế bào đơn nhân trong máu bệnh nhân và nuôi cấy chung với tế bào đơn nhân của người lành đã được hoạt hóa trong môi trường nuôi cấy PHA (phytohemagglutinin) thích hợp.
    - Xác định sự nhân lên của virus bằng kỹ thuật:
    * ELISA phát hiện KN p24 trong nước nổi môi trường nuôi cấy tế bào.
    * Dùng đồng vị phóng xạ phát hiện enzyme sao chép ngược của virus (RT).
    4.2.2. Phát hiện các axit nucleic (RNA) của virus hoặc DNA (provirut) trong tế bào nhiễm.
    * RNA của virus HIV bằng kỹ thuật RT-PCR:
    · RNA enzyme sao chép ngược và mồi cDNA
    · Quá trình PCR là chuỗi nhiều chu kỳ kế tiếp nhau.
    Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
    - Bước 1: biến tính tách rời 2 chuỗi của phân tử DNA đích ở nhiệt độ 940 – 950.
    - Bước 2: bắt cặp, các cặp mồi đặc hiệu cho một trình tự DNA xác định bắt cặp với sợi DNA đích ở nhiệt độ 400 -700.
    - Bước 3: tổng hợp, kéo dài. Ở nhiệt độ 720, Taq polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA có trình tự bổ sung cho sợi khuôn.
    - Trong chẩn đoán nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh, ngoài RT- PCR còn dùng PCR phát hiện các DNA provirút trong tế bào nhiễm.
    - PCR được thực hiện trên 3 vùng gen: env, gag và pol.
    - Kết quả được trả lời dương tính khi có PCR dương tính ít nhất là trên hai trong ba gen và được thực hiện trên hai mẫu máu ở thời điểm khác nhau.
    * Ưu điểm: có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh chóng.
    * Hạn chế: phải có cơ sở phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn và trang thiết bị đắt tiền. Cán bộ cần đào tạo tốt.
    4.2.3. Phát hiện KN p24 của virus trong máu
    - p24 l một chỉ số trực tiếp phản ánh sự nhân lên của virut
    - Được phát hiện sớm trong giai đoạn mới nhiễm.
    - Giảm khi có KT kháng p24.
    - Gia tăng khi chuyển sang giai đoạn AIDS
    Kit phát hiện p24: ELISA sandwich.
    * Nguyên lý:
    KT đơn dòng kháng với KN p24 được gắn sẵn trong các giếng, nếu mẫu thử có KN p24 sẽ gắn với KT này và được phát hiện bằng cộng hợp (KT đa dòng kháng HIV) gắn men cho phản ứng màu với cơ chất.

    4.3. Lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm HIV.
    4.3.1. Sự biến động của các thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm HIV chưa điều trị.
    - Kháng nguyên HIV đặc hiệu KNp24 xuất hiện sớm, một thời gian ngắn sau nhiễm HIV và duy trì trong suốt thời gian cấp (sớm) của nhiễm HIV. Sau đó KNp24 giảm dần đồng thời có sự xuất hiện KTp24. Điều này báo hiệu giai đoạn không triệu chứng của nhiễm HIV.
    - Vài tháng tới vài năm sau nhiễm trùng, KTp24 mất đi v KNp24 tái xuất hiện, báo giai đoạn triệu chứng của bệnh. Sự nhân lên của HIV tương ứng với sự có mặt của KNp24.
    - Kháng thể HIV: Trước tiên kháng thể HIV lớp IgM xuất hiện, sau đó giảm dần và thay vào đó là KT lớp IgG. IgG khng p24 xuất hiện và giảm dần cùng với sự mất đi và xuất hiện lại KN HIV. Trong khi đó IgG kháng KN vỏ của HIV tồn tại lâu dài trong suốt thời gian bị nhiễm.
    4.3.2. Lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm HIV
    4.3.2.1. Nguyên tắc chung.
    - Mục đích xét nghiệm.
    - Thời điểm phơi nhiễm.
    - Đối tượng xét nghiệm.
    - Tỷ lệ nhiễm trong quần thể.
    - Thời gian cần trả lời kết quả.
    - Điều kiện cụ thể của phòng thí nghiệm.
    - Tư vấn trước xét nghiệm.
    4.3.2.2. Lựa chọn cụ thể
    4.3.2.2.1. Giai đoạn ủ bệnh:" giai đoạn cửa sổ sinh học". Giai đoạn này từ khi nhiễm HIV 1 tuần lễ: một số kỹ thuật có thể giúp ích chẩn đoán như:
    - Phân lập virus.
    - PCR.
    - Phát hiện kháng nguyên p24.
    - Phát hiện kháng thể Ig (kỹ thuật ELISA sandwich)
    4.3.2.2.2. Giai đoạn có kháng thể
    Kỹ thuật:
    - Serodia.
    - ELISA.
    - Test nhanh.
    - Western blot.
    4.3.3. Nhận định kết quả.
    4.3.3.1. Các phương pháp trực tiếp:
    - Dương tính: kết luận dương tính.
    - Âm tính: kết luận âm tính.
    4.3.3.2. Các phương pháp xét nghiệm gián tiếp:
    - Mẫu thử nghiệm âm tính lần đầu: kết luận âm tính.
    - Để khẳng định mẫu HIV dương tính: Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với khi mẫu đó dương tính cả ba lần xét nghiệm bằng ba loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.
    QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM TẠI PHÒNG HIV BỆNH VIỆN PHONG - DA LIỄU TRUNG ƯƠNG QUY HOÀ
    5. Kết luận: Để kết luận tình trạng mẫu thử là dương tính khi:
    5.1. Tính hợp lệ của thử nghiệm:
    Theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất sinh phẩm.
    5.2. Chỉ thực hiện tại các phòng thí nghiệm HIV được phép khẳng định HIV dương tính.
    5.3. Theo đúng hướng dẫn sử dụng sinh phẩm và đúng phương cách xét nghiệm.
    5.4. Nếu kết quả giữa các thử nghiệm không phù hợp, hẹn 3 tháng sau lấy mẫu xét nghiệm lại.

    Tài liệu tham khảo
    1. Phạm nhật An và cs (1995), Nhiễm HIV/AIDS y học cơ sở, lâm sàng và phòng chống, NXBY học, Hà nội, 26-51.
    2. Trần chí Liêm và CS (11-2001), xét nghiệm chẩn đoán HIV, Hà nội, 4-28.
    3. Trương xuân Liên, tài liệu tập huấn tại viên Pasteur TPHCM


  5. #4
    Admin diendanhiv.vn
    ( Sanh năm 1971 )
    Tuanmecsedec's Avatar
    Ngày tham gia
    29-08-2007
    Giới tính
    Nam
    Đến từ
    Giấy chứng nhận tham vấn số : 041/UB AIDS - TV do ủy ban phòng chống HIV/AIDS TPHCM.
    Bài viết
    74,838
    Cảm ơn
    3,481
    Được cảm ơn: 18,160 lần
    KỸ THUẬT REAL-TIME PCR
    TRONG ĐỊNH LƯỢNG HIV-1 RNA


    Trần Chí Thành, Trần Tôn, Trương Thị Xuân Liên
    Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh
    Tóm tắt

    Định lượng vi rút HIV trong máu là một thông số quan trọng trong chỉ định và theo dõi điều trị cũng như trong chẩn đoán sớm nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh.
    Trên thị trường đã có nhiều bộ sinh phẩm dùng để xác định số lượng vi rút HIV trong máu. Tuy nhiên việc sử dụng còn tương đối hạn chế nhất là ở các nước đang phát triển do giá thành cao và một số sinh phẩm chỉ có hiệu suất tốt đối với HIV-1 týp B lưu hành chính ở châu âu và Bắc Mỹy4 ANRS Cơ quan quốc gia nghiên cứu về Sida và các vi rút viêm gan của Cộng Hòa Pháp (ANRS) đã nghiên cứu và phát triển bộ kit Generique với giá thành thấp do sử dụng kỹ thuật real-time PCR và có hiệu suất cao với hầu hết các thứ týp di truyền của HIV-1 do thiết kế các mồi và mẫu dò trên vùng gen LTR (Long Terminal Repeats) có tính bảo tồn cao giữa các thứ týp di truyền của HIV-1.
    Mục tiêu:

    Nghiên cứu triển khai và đánh giá khả năng sử dụng bộ kit Generique trong định lượng HIV-1 tại phòng xét nghiệm HIV/AIDS của Viện Pasteur TP. HCM nhằm phục vụ chẩn đoán theo dõi số lượng vi rút HIV-1 trong máu cho bệnh nhân nhiễm HIV trong điều trị bằng ARV và chẩn đoán sớm nhiễm HIV cho trẻ (<18 tháng tuổi) có mẹ bị nhiễm HIV.
    Vật liệu và phương pháp:

    114 mẫu máu trẻ (<18 tháng tuổi) bao gồm 58 mẫu có HIV-1 DNA dương tính và 56 mẫu âm tính HIV-1 DNA.
    10 mẫu huyết tương chuẩn của tổ chức ANRS (Pháp) và 20 mẫu huyết tương chuẩn của tổ chức NIH (Hoa Kỳ) dùng để kiểm tra chất lượng từ bên ngoài (External Quality Assurance)
    Tất cả các mẫu được tiến hành định lượng HIV-1 RNA bằng bộ kit Generique và theo đúng quy trình chuẩn do bộ kit hướng dẫn và được thực hiện trên hệ thống máy realtime PCR ABI 7500.
    Kết quả:

    Tất cả 56 mẫu âm tính HIV-1 DNA thì không phát hiện HIV-1 RNA trong huyết tương bằng kỹ thuật realtime.
    Tất cả 58 mẫu dương tính HIV-1 DNA thì đã phát hiện và xác định được số lượng HIV-1 RNA trong huyết tương.
    Kết quả phản hồi từ 2 tổ chức ANRS và NIH về kết quả định lượng các bộ mẫu huyết thanh chuẩn, các giá trị về số lượng bản mẫu HIV-1 RNA (giá trị tuyệt đối, giá trị log) đều không khác biệt với kết quả gốc (p<0. 01).
    Kết luận:

    Quy trình kỹ thuật và chất lượng xét nghiệm khi sử dụng bộ kit Generique đã được đánh giá với kết quả tốt bởi 2 hệ thống kiểm tra chất lượng quốc tế, do đó có thể ứng dụng rộng rãi và triển khai phục vụ cho công tác theo dõi điều trị của bệnh nhân. Việc ứng dụng trong chẩn đoán sớm nhiễm HIV cho trẻ (< 18 tháng tuổi) có khả quan cao vì sự tương đồng kết quả 100% giữa kỹ thuật định lượng HIV-1 RNA so với kỹ thuật PCR “tổ” phát hiện DNA bộ gen HIV-1 trong tế bào bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi. Giá thành xét nghiệm thấp so với các kỹ thuật định lượng khác.


    Một số kết quả minh họa :





  6. #5
    Admin diendanhiv.vn
    ( Sanh năm 1971 )
    Tuanmecsedec's Avatar
    Ngày tham gia
    29-08-2007
    Giới tính
    Nam
    Đến từ
    Giấy chứng nhận tham vấn số : 041/UB AIDS - TV do ủy ban phòng chống HIV/AIDS TPHCM.
    Bài viết
    74,838
    Cảm ơn
    3,481
    Được cảm ơn: 18,160 lần
    Thông tin xét nghiệm :

    Kỹ thuật chuẩn đoán :

    1.Phương pháp trực tiếp
    - phân lập virút bằng nuôi cấy tế bào nhiễm
    - Tìm chất liệu di truyền(ARN và ADN provirus) bằng kỹ thuật PCR
    - Phát hiện kháng nguyên virút trong máu.

    1.1 Phát hiện kháng nguyên virus trong máu
    Kháng nguyên p24 là protein cấu trúc của HIV bao bọc các chất liệu di truyền.
    P24 phản ánh trực tiếp khả năng nhân đôi của virút.
    Tồn tại tự do hay kết hợp kháng nguyên kháng thể

    1.2 XN phát hiện kháng nguyên P24,sử dụng trong :
    -Chuẩn đoán nhiễm HIV trẻ sơ sinh
    -Giai đoạn sơ nhiễm(giai đoạn cửa sổ)
    -Tầm soát hiến máu tại ngân hàng máu

    1.3 Phát hiện kháng nguyên HIV còn hạn chế sử dụng do :
    - Độ nhạy và độ đặc hiệu thấp
    - Thực hiện phức tạp nhiều công đoạn (định tính,định lượng,trung hoà)
    - P24 chỉ xuất hiện trước khi có kháng thể 6 ngày.
    - Giá thành cao

    2.Phương pháp gián tiếp
    Phát hiện kháng thể kháng HIV trong máu
    2.1 Thử nghiệm sàng lọc :

    Kỹ thuật ngưng kết vi lượng :SÉDORIA - HIV 1,SFP HIV 1 - 2
    Kỹ thuật miễn dịch gắn men : ELISA
    Thử nghiệm nhanh

    2.2 Thử nghiệm xác định
    Kỹ thuật miễn dịch (huỳnh quang - phóng xạ - dải băng)
    Kỹ thuật miễn dịch điện di WESTERN BLOT

    2.3 Các thử nghiệm khác : Thử nước bọt,nước tiểu
    3. Kỹ thuật ngưng kết hạt
    Nguyên tắc :
    phản ứng ngưng kết thụ động
    Những hạt gelatin được gắn với các thành phần kháng nguyên,HIV sẽ ngưng kết khi có sự hiện diện của kháng thể tương ứng trong huyết thanh(huyết tương) của bệnh nhân.

    Thuận lợi :
    -Dễ làm,thực hiện nhanh
    - Không cần máy móc,dụng cụ đắt tiền
    - Có thể làm số lượng hàng loạt hay ít mẫu
    - Đọc kết quả bằng mắt thường
    - Độ đặc hiệu cao

    4 Kỹ thuật miễn dịch gắn men : ELISA

    Chuẩn đoán nhiễm HIV

    +
    Chẩn đoán dựa vào XN kháng nguyên hoặc là XN kháng thể
    1.Xét nghiệm kháng thể

    - ELISA : sàng lọc
    -Test nhanh :sử dụng hạn chế
    - Western blot : xác định
    - các loại test khác (serodia)
    *
    Tiêu chuẩn vàng quốc tế (international gold standards) áp dụng cho các nước phát triển
    Nhiễm HIV = 2 ELISA(+) + 1 western blot (+)
    Bất lợi : Đắt tiền,kết quả cần có người thành thạo diễn giải

    *
    Xét nghiệm theo chuẩn đoán nhiễm HIV theo quyết định của bộ trưởng BỘ Y TẾ số 1451/2000/QĐ-BYT ngày 8/5/2000.
    (Trên xuống = ngang)
    XN lần 1 :

    Serodia -HIV hoặc Quick test
    Elisa - HIV uniform II
    Elisa - Genscreen HIV
    Serodia HIV hoặc Quick test

    XN lần 2 :
    Elisa - HIV uniform II
    Serodia - HIV hoặc Quick test
    Serodia - HIV hoặc Quick test
    Elisa - grenscreen HIV

    XN lần 3 :
    Elisa - grenscreen HIV
    Elisa - grenscreen HIV
    Elisa - HIV uniform II
    Elisa - HIV uniform II

    Kết quả :
    3 test (+) ==> nhiễm HIV
    3 test (+) ==> nhiễm HIV
    3 test (+) ==>nhiễm HIV
    3 test (+) ==>nhiễm HIV

    Theo UNAIDS và WHO
    1992 : hạn chế dùng Western blot
    Dùng chiến lược 3 xét nghiệm dựa trên mục tiêu và tỉ lệ nhiễm HIV ở từng đối tượng
    1998 : Sửa chữa bổ sung vì độ nhạy của XN ngày càng cao,phối hợp nhiều test ELISA hoặc ELISA với test nhanh.
    Không dùng tiêu chuẩn vàng 2 ELISA + 1 Western blot


    2. Thử nghiệm nhanh :
    Ưu đỉểm:

    - Cho kết quả trong 10 phút
    - Phương tiện có giá trị tại phòng cấp cứu,thử nghiệm nhanh xảy ra trên giá đỡ dùng những hạt nhỏ có tầm kháng nguyên
    - Đọc kết quả bằng mắt thường,không cần trang bị
    - Thử nghiệm có khả năng phân biệt HIV 1 và HIV 2
    Hạn chế :
    - Không phù hợp cho những nơi xét nghiệm có mẫu cỡ lớn
    - Độ đặc hiệu cao nhưng kém nhạy hơn ELISA
    - Hạn chế sử dụng trong sàng lọc đầu tiên
    - Giá thành đắt hơn ELISA

    3. Thử nghiệm nước bọt
    - Kháng thể IgA trong hạch nước bọt
    - - Kháng thể IgG hiện diện trong các dịch tiết với nồng độ rất thấp
    - Tổ chức y tế thế giới đang kiến nghị đánh giá nhằm phát triển việc phát hiện kháng thể kháng HIV trong dịch ở miệng.

    4. Thử nghiệm nước tiểu
    - Kháng thể trong nước tiểu có nồng độ rất thấp nên mẫu thử phải được cô đặc.
    - Các nghiên cứu phát triển kỹ thuật này đang có nhiều thuận lợi.


    (Nguồn : Tài liệu huấn luyện TVV,UBPC AIDS TP.HCM,6/2008)

  7. #6
    Admin diendanhiv.vn
    ( Sanh năm 1971 )
    Tuanmecsedec's Avatar
    Ngày tham gia
    29-08-2007
    Giới tính
    Nam
    Đến từ
    Giấy chứng nhận tham vấn số : 041/UB AIDS - TV do ủy ban phòng chống HIV/AIDS TPHCM.
    Bài viết
    74,838
    Cảm ơn
    3,481
    Được cảm ơn: 18,160 lần
    Chẩn đoán giai đọạn nhiễm HIV theo WHO 1993

    - Dựa vào CD4 và số lượng lymphocytes,nhiễm HIV được chia làm 3 giai đoạn A,B,C
    CD4/mm3 Số lượng lymphocytes/mm3
    A >500 >2000
    B 200 - 499 100 - 1999
    C <200 <1000

    - Dựa trên lâm sàng,nhiễm HIV có 4 giai đoạn
    1. Chưa có triệu chứng
    2. Triệu chứng nhẹ
    3. Triệu chứng nặng vừa
    4. Rất nặng.
    AIDS = Xét nghiệm nhóm C và/hoặc là lâm sàng nhóm 4

    5. Wesrern Blot
    Thử nghiệm xác định : kỹ thuật miễn dịch điện di WB đặc hiệu cho phép xác định các kháng thể kháng từng loại protein khác nhau của HIV.

    5 Thu thập và chuyển mẫu
    1 Cách thu thập mẫu
    - Lấy máu tĩnh mạch,khoảng 1 đến 2 ml,không cần nhịn ăn.
    - Sau khi lấy máu,cần phải lấy kim ra khỏi ống tiêm và bơm máu trực tiếp vào ống,không đậy kim lại vì dễ bị kim đâm vào tay.
    - Cần ghi mã số trên ống trùng với mã số của mẫu trong sổ theo dõi.
    - Huyết thanh được bảo quản ở 4 độ c trong vòng 24h,nếu lâu hơn phải để trong ngăn đá.
    - Phải có chế độ lưu giữ mẫu dương tính hoặc nghi ngờ.
    - Để thẳng đứng khi vận chuyển mẫu trong ống nhựa và có nắp đậy vặn xoắn.
    2 Chuyển mẫu máu về nơi xét nghiệm khẳng định
    - Đơn vị không có điều kiện xét nghiệm : gửi mẫu về labo có chức năng khẳng định để thực hiện và kèm phiếu xét nghiệm ghi rõ các chi tiết như trong sổ theo dõi.
    - Đon vị có điều kiện xét nghiệm : Gửi mẫu dương tính lần một và lần hai về labo khẳng định trước khi thông báo cho bệnh nhân có kèm phiếu ghi rõ chi tiết như sổ theo dõi và kết quả xét nghiệm với tên thuốc thử và độ đậm quang học (ELISA).
    3.Trả lời kết quả
    - Ghi rõ kết quả các test xét nghiệm và có kết luận.kết quả chỉ có giá trị từ thời điểm lấy mẫu trở về trước.
    + Âm tính với test 1 : Không phát hiện kháng thể kháng HIV
    Dương tính với test 1,thực hiện test 2
    + Âm tính với test 2 : Chưa phát hiện kháng thể kháng HIV,tham vấn và đề nghị xét nghiệm lại sau 4 tuần.
    Dương tính với test 2,thực hiện test 3
    + Âm tính với test 3 : Chưa phát hiện kháng thể kháng HIV,tham vấn,đề nghị xét nghiệm lại sau 4 tuần.
    Dương tính với test 3: Xác định nhiễm HIV,kháng thể HIV dương tính,đề nghị tham vấn

    - Thực hiện 3 test (khác nhau) trên cùng mẫu máu.
    +Dương tính với test 1 sẽ thực hiện tiếp test 2
    +Dương tính với test 2 sẽ thực hiện test 3
    +Dương tính với test 3 xác định mẫu có kháng thể kháng HIV

    6. Phương cách xét nghiệm
    1. Phương cách xét nghiệm : Tuỳ theo mục tiêu xét nghiệm
    Phương cách 1 : An toàn truyền máu,hiến cơ quan và tinh dịch
    Phương cách 2 : Giám sát trọng điểm
    phương cách 3 : Chẩn đóan mọi trường hợp và trên mọi đối tượng
    (Hiện nay đang áp dụng phương cách 3 trong xét nghiệm HIV)
    2. Xét nghiệm khẳng định :
    + khi có yêu cầu trong nghiên cứu khoa học
    + khi có chỉ định đặc biệt
    + khi cần bằng chứng pháp lý.
    3. Nghiêm cấm trộn lẫn các mẫu huyết thanh (phương pháp pool)

    Phương cách 3 :

    Huyết thanh

    lần 1 : Elisa/test nhanh/ngưng kết
    (+) (-)
    lần 2 : Elisa/ngưng kết Không phát hiện kháng thể kháng HIV
    (+) (-)
    lần 3 : Elisa/ngưng kết --->Chưa phát hiện kháng thể kháng HIV
    (+) tham vấn,đề nghị xét nghiệm lại sau 4 tuần
    Kháng thể HIV dương tính

    (Nguồn : Tài liệu huấn luyện TVV,UBPC AIDS TP.HCM,6/2008)

  8. #7
    Admin diendanhiv.vn
    ( Sanh năm 1971 )
    Tuanmecsedec's Avatar
    Ngày tham gia
    29-08-2007
    Giới tính
    Nam
    Đến từ
    Giấy chứng nhận tham vấn số : 041/UB AIDS - TV do ủy ban phòng chống HIV/AIDS TPHCM.
    Bài viết
    74,838
    Cảm ơn
    3,481
    Được cảm ơn: 18,160 lần
    CÁC NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM HIV

    Nguyễn Hoàng Ân

    1. Đại cương:

    1.1. Cấu trúc của virus HIV.


    CẤU TRÚC CỦA VIRUS HIV



    HIV có đặc điểm chung của họ retroviridae. Hạt virus hoàn chỉnh (virion) có cấu trúc gồm 3 lớp.

    1.1.1. Lớp vỏ ngoài (vỏ peplon): lớp này là 1 màng lipid kép có kháng nguyên chéo với màng nguyên sinh chất tế bào. Gắn lên màng này là các nhú. Đó là các phân tử Glycoprotein có trọng lượng phân tử 160 kilodalton (gp160). Nó gồm có 2 phần:
    + Glycoprotein màng ngoài có trọng lượng phân töû là 120 kilodalton (gp120). GP120 là kháng nguyên deã biến đổi nhất, gây khó khăn cho phản ứng bảo vệ cơ thể và chế vaccin phòng bệnh.
    + Glycoprotein: xuyên màng có trọng lượng phân töû 41 kilodalton.

    1.1.2. Vỏ trong (vỏ capsid): vỏ này gồm 2 lớp protein:
    + Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi protein có trọng lượng phân töû 18 kilodalton (p18).
    + Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi các phân töû có trọng lượng phân tử là 24 kilodalton (p24). Đây là kháng nguyên rất quang trọng để chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS.

    1.1.3. Lõi:
    Là những thành phần bên trong của vỏ capsid, bao gồm:
    + Hai phân tử ARN đơn, đó là bộ gen di truyền HIV(genom).
    Genom của HIV chứa 3 gen cấu trúc: Gag (group specific antigen) là cac gen mã hoá cho các kháng nguyên đặc hiệu của capsid cuûa virus; Pol (polymerase) mã hoá cho các Enzym: reverve transcriptase (RT:Enzym sao mã ngược), protease và endonuclease (còn gọi kháng nguyên integrase); và EnV (envelop) mã hoá cho glycoprotein lớp vỏ peplon của HIV.

    1.2. Sự xâm nhập vào tế bào và nhân lên của virus HIV.



    1.2.1. Sự hấp phụ lên bề mặt tế bào.
    HIV bám vào bề mặt tế bào cảm thụ nhờ sự phù hợp giữa Receptor tế bào với GP120 của nó. Trong đa số các trường hợp, các receptor này là các phân tử CD4 của lympho T hỗ trợ hoặc một soá tế bào khác như bạch cầu đơn nhân lớn, đại thực bào và 1 số tế bào doøng lympho.

    1.2.2. Sự xâm nhập vào tế bào:
    Sau khi đã bám vào các receptor của tế bào vật chủ , phân tử gp41 của HIV cắm sâu vào màng tế bào. Nhờ đó genom của HIV chui vào bên trong của tế bào. Vì vậy giai đoạn này còn gọi là ‘cắm neo và hoà màng’.

    1.2.3. Sự nhân lên trong tế bào:

    1.2.3.1. Sao mã sớm: nhờ RT, ADN bổ sung của HIV đã được tạo thành (đã được tạo thành) từ khuôn mẫu ARN của nó. Lúc đầu là sản phẩm lai ARN_ADN, sau đó nhờ Enzym ARN_ase tách ARN khỏi ADN và sợi ADN bổ sung mới được tổng hợp, tạo thành phân tử ADN chuỗi kép.


    1.2.3.2. Tích hợp.
    Sau khi tổng hợp ADN kép tạo thành dạng vòng khép kín và chui vào nhân tế bào chủ. Sau đó nó tích hợp vào ADN nhờ integrase .
    Nhờ tích hợp, HIV đã tránh được sự bảo vệ cơ thể, tác dụng của thuốc và gây bệnh chậm.
    Sau khi tích hợp, AND của HIV có toàn tại ở một trong 2 trạng thái:
    - Không hoạt động và nằm im như tiền virus. Trạng thái tiềm tàng này có thể trở thành hoạt động như những virus độc lực dưới các tác động của môi trường.
    - ADN bổ sung của HIV được sao chép thành hạt virion mới. Ñây là trạng thái nhân lên của HIV với các bước tiếp theo như sau:

    1.2.3.3. Sao mã muộn:
    ADN boå sung của HIV được sao mã thành ARN genom và ARN thoâng tin cho nó (mARN)

    1.2.3.4. Dịch mã:
    Nhờ mARN được tạo thành ở giai đoạn trên, các prrotein cần của HIV được toång hợp.

    1.2.3.5. Lắp ráp các hạt virion mới:
    Từ các thành phần đã được toång hợp, các hạt HIV mới được lắp ráp ở bào tương tế bào.

    1.2.3.6. Giải phóng các hạt HIV mới:
    Từ các vị trí lắp ráp các hạt HIV gần màng nguyên sinh chất, các màng này nảy chồi và các hạt HIV được giải phóng. Chúng tiếp tục gây nhiễm cho tế bào mới, còn tế bào đã giúp chúng nhân lên thì bị diệt.

    2. Mục tiêu xét nghiệm HIV.

    2.1. Giám sát HIV/AIDS.

    2.2. An toàn truyền máu.

    2.3. Chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS.

    2.4. Nghiên cứu khoa học.

    3. Các phương cách xét nghiệm HIV.

    3.1. Phương cách I. (áp dụng cho công tác an toàn truyền máu):
    Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách I khi mẫu đó dương tính với một trong các thử nghiệm như: ELISA, Serodia hay thử nghiệm nhanh.
    Trong truyền máu, mẫu máu được xét nghiệm với phương cách I nếu dương tính hay nghi ngờ đều phải loại bỏ.

    3.2. Phương cách II: (áp dụng cho giám sát trọng điểm):
    Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách II khi mẫu đó dương tính cả hai lần xét nghiệm bằng hai loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.

    3.3. Phương cách III: (chẩn đoán nhiễm HIV).
    Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách III khi mẫu đó dương tính cả ba lần xét nghiệm bằng ba loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.

    4. Các nguyên lý và phương pháp xét nghiệm HIV.

    4.1. Phương pháp gián tiếp:
    Phát hiện kháng thể kháng HIV trong máu, dịch tiết.
    Áp dụng:
    - Giám sát dịch tễ.
    - Chẩn đoán nhiễm HIV trên 18 tháng tuổi.
    Các kỹ thuật tìm kháng thể được chia thành 2 loại:
    * Các xét nghiệm phát hiện sàng lọc: cần có độ nhạy cao.
    * Các xét nghiệm khẳng định: cần độ đặc hiệu cao.

    4.1.1. Xét nghiệm phát hiện sàng lọc.

    Các kỹ thuật: ELISA, các thử nghiệm nhanh có độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau. Phối hợp các kỹ thuật khác nhau trong các phương cách xét nghiệm phải tuân theo nguyên tắc:
    * Thử nghiệm đầu tiên có độ nhạy cao.
    * Các thử nghiệm tiếp theo có nguyên lý hoặc cách chuẩn bị KN khác nhau và cần có độ đặc hiệu cao.

    4.1.1.1. Thử nghiệm miễn dịch gắn men – Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
    * Nguyên lý chung:
    - Kháng nguyên (Ag) virus cố định trên phiến nhựa.
    - Kháng thể (Ab) kháng HIV của bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với Ag.
    - Phức hợp Ag-Ab được phát hiện bởi hệ thống cộng hợp gắn enzyme và cho phản ứng hiện màu với cơ chất tương ứng.

    4.1.1.1.1. ELISA gián tiếp: Độ nhạy cao huyết thanh cần thử ủ với bản nhựa đã gắn kháng nguyên, sau khi rửa để loại kháng thể thừa, không đặc hiệu, lại tiếp tục ủ với kháng thể kháng globulinngười gắn Enzym. Hoạt tính Enzym sẽ biến cơ chất không màu thành một sản phẩm có màu. Phản ứng màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường và đọc chính xác bằng quang kế.



    Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể


    4.1.1.1.2. ELISA sandwich: độ đặc hiệu và độ nhạy cao.
    Cũng tương tự kỷ thuật ELISA gián tiếp chỉ khác là kháng nguyên virus có gắn Enzym được thay kháng thể globlin người gắn enzym. Như vậy hình thành 1 Sandwich của phức hợp KN_KT_KN_Enzym. Sự thay đổi này làm tăng độ nhạy và đô đặc hiệu của phản ứng, nó cũng cho cho phép phát hiện tất cả các lớp kháng thể vì không dùng Anti IgG người gắn Enzym.


    Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể


    Ví dụ:


    4.1.1.1.3. ELISA cạnh tranh: Độ nhạy cao.
    Nguyên lý phản ứng tương tự như hai loại trên song chỉ khác là huyết thanh của mẫu thử có KT kháng HIV ủ cùng với kháng thể kháng HIV có gắn Enzym. Như vậy có sự tranh chấp giữa hai loại kháng thể trong phản ứng kết hợp với KN-KT đã gắn vào pha rắn, Đậm độ KT trong mẫu thử càng cao thì KT càng ít được cố định vào KN . Cơ chất sẽ cho 1 phản ứng màu tỉ lệ nghịch với đâm đô KT của màu phải thử.


    ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH GẮN MEN – ELISA.

    * Ưu điểm:
    - Thực hiện đồng thời được nhiều mẫu.
    - Đọc kết quả bằng máy không phụ thuộc vào chủ quan của con người.
    - Có thể lưu kết quả, thuận lợi cho kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm.
    - Giá thành tương đối rẻ.

    * Hạn chế:
    - Phải đầu tư trang thiết bị ban đầu và bảo dưỡng máy.
    - Sinh phẩm phải bảo quản lạnh.
    - Nhân viên xét nghiệm phải được đào tạo.
    - Thời gian thực hiện: 3 – 4 giờ.
    - Nếu số lượng mẫu ít thì tốn kém vì phải làm nhiều chứng.

    4.1.1.2. Các thử nghiệm nhanh.

    4.1.1.2.1. Thử nghiệm ngưng kết hạt Serodia:
    - Nguyên lý:
    Những hạt gelatin được gắn với các thành phần KN của virus HIV sẽ tạo ngưng kết khi trong huyết thanh (hoặc huyết tương) bệnh nhân có KT kháng HIV.
    - Kháng nguyên được gắn trên hạt gelatin:
    HIV 1 gp41 protein tái tổ hợp.
    HIV 1 p24 protein tái tổ hợp.
    HIV2 gp36 protein tái tổ hợp.




    4.1.1.2.2. Các thử nghiệm nhanh:
    - Kit Determine HIV1/2: dựa trên nguyên lý miễn dịch sắc ký. (Thường sử dụng để kiểm tra HIV gấp và luôn phải được kiểm chứng bằng kỹ thuật khác)
    - Kit Multispot HIV1/2: là phương pháp miễn dịch trên màng lọc, dựa trên nguyên lý ELISA (Phân biệt được HIV1 và HIV2).



    * Ưu điểm:
    - Xét nghiệm với số lượng mẫu nhỏ.
    - Dễ thực hiện, cho kết quả nhanh.
    - Không đòi hỏi thiết bị đặc biệt, sinh phẩm dễ bảo quản.
    - Có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở.
    - Xét nghiệm viên có thể được đào tạo nhanh.

    * Nhược điểm:
    - Giá thành cao.
    - Không thuận lợi khi xét nghiệm số mẫu lớn.
    - Không lưu được dữ liệu kỹ thuật.
    - Một số test nhanh có độ nhạy kém hơn so với ELISA.

    4.1.2. Xét nghiệm khẳng định.
    Western blot (Kit New Lab blot I ):

    4.1.2.1. Nguyên lý:
    - Protein Virus HIV được tách theo PM bằng điện di trên gel polyacrylamid.
    - Chuyển sang giấy nitrocellulose, các protein định vị theo PM.
    - KT kháng HIV trong mẫu thử kết hợp đặc hiệu với KN tương ứng.
    - Phát hiện phức hợp KN-KT bằng cộng hợp KT kháng IgG gắn men, cho phản ứng màu với cơ chất tại các vị trí có KT đặc hiệu với KN tương ứng. Western blot có độ nhạy và độ đặc hiệu cao; song giá thành cao và đòi hỏi người xét nghiệm phải có trình độ và kinh nghiệm.



    4.1.2.2. Biện luận kết quả.
    * WB âm tính: không có băng nào
    * WB dương tính: có ít nhất 2 băng tương ứng với proteine vỏ:
    HIV 1: gp 160, gp 120, gp 41
    HIV 2: gp 140, gp 125, gp 36 ngoài ra có các băng tương ứng với sản phẩm của gen gag/pol.
    * WB chưa xác định : có băng ở vị trí khác tiêu chuẩn WB dương tính.

    4.2. Phương pháp trực tiếp:
    Phát hiện trực tiếp: KN virus, axit nucleic hoặcVirus.
    Áp dụng:
    - Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV.
    - Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện KT không rõ ràng.
    - Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virút và trong các mục đích nghiên cứu khác.

    4.2.1. Phân lập virus bằng nuôi cấy tế bào.
    Nguyên lý:
    - Tách tế bào đơn nhân trong máu bệnh nhân và nuôi cấy chung với tế bào đơn nhân của người lành đã được hoạt hóa trong môi trường nuôi cấy PHA (phytohemagglutinin) thích hợp.
    - Xác định sự nhân lên của virus bằng kỹ thuật:
    * ELISA phát hiện KN p24 trong nước nổi môi trường nuôi cấy tế bào.
    * Dùng đồng vị phóng xạ phát hiện enzyme sao chép ngược của virus (RT).

    4.2.2. Phát hiện các axit nucleic (RNA) của virus hoặc DNA (provirut) trong tế bào nhiễm.
    * RNA của virus HIV bằng kỹ thuật RT-PCR:
    • RNA enzyme sao chép ngược và mồi cDNA
    • Quá trình PCR là chuỗi nhiều chu kỳ kế tiếp nhau.

    Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
    - Bước 1: biến tính tách rời 2 chuỗi của phân tử DNA đích ở nhiệt độ 940 – 950.
    - Bước 2: bắt cặp, các cặp mồi đặc hiệu cho một trình tự DNA xác định bắt cặp với sợi DNA đích ở nhiệt độ 400 -700.
    - Bước 3: tổng hợp, kéo dài. Ở nhiệt độ 720, Taq polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA có trình tự bổ sung cho sợi khuôn.

    - Trong chẩn đoán nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh, ngoài RT- PCR còn dùng PCR phát hiện các DNA provirút trong tế bào nhiễm.
    - PCR được thực hiện trên 3 vùng gen: env, gag và pol.
    - Kết quả được trả lời dương tính khi có PCR dương tính ít nhất là trên hai trong ba gen và được thực hiện trên hai mẫu máu ở thời điểm khác nhau.

    * Ưu điểm: có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh chóng.
    * Hạn chế: phải có cơ sở phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn và trang thiết bị đắt tiền. Cán bộ cần đào tạo tốt.







    4.2.3. Phát hiện KN p24 của virus trong máu.
    - p24 là một chỉ số trực tiếp phản ánh sự nhân lên của virut
    - Được phát hiện sớm trong giai đoạn mới nhiễm.
    - Giảm khi có KT kháng p24.
    - Gia tăng khi chuyển sang giai đoạn AIDS

    Kit phát hiện p24: ELISA sandwich.
    * Nguyên lý:
    KT đơn dòng kháng với KN p24 được gắn sẵn trong các giếng, nếu mẫu thử có KN p24 sẽ gắn với KT này và được phát hiện bằng cộng hợp (KT đa dòng kháng HIV) gắn men cho phản ứng màu với cơ chất.

    4.3. Lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm HIV.

    4.3.1. Sự biến động của các thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm HIV chưa điều trị.
    - Kháng nguyên HIV đặc hiệu KNp24 xuất hiện sớm, một thời gian ngắn sau nhiễm HIV và duy trì trong suốt thời gian cấp (sớm) của nhiễm HIV. Sau đó KNp24 giảm dần đồng thời có sự xuất hiện KTp24. Điều này báo hiệu giai đoạn không triệu chứng của nhiễm HIV.
    - Vài tháng tới vài năm sau nhiễm trùng, KTp24 mất đi v KNp24 tái xuất hiện, báo giai đoạn triệu chứng của bệnh. Sự nhân lên của HIV tương ứng với sự có mặt của KNp24.
    - Kháng thể HIV: Trước tiên kháng thể HIV lớp IgM xuất hiện, sau đó giảm dần và thay vào đó là KT lớp IgG. IgG khng p24 xuất hiện và giảm dần cùng với sự mất đi và xuất hiện lại KN HIV. Trong khi đó IgG kháng KN vỏ của HIV tồn tại lâu dài trong suốt thời gian bị nhiễm.



    4.3.2. Lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm HIV

    4.3.2.1. Nguyên tắc chung.
    - Mục đích xét nghiệm.
    - Thời điểm phơi nhiễm.
    - Đối tượng xét nghiệm.
    - Tỷ lệ nhiễm trong quần thể.
    - Thời gian cần trả lời kết quả.
    - Điều kiện cụ thể của phòng thí nghiệm.
    - Tư vấn trước xét nghiệm.

    4.3.2.2. Lựa chọn cụ thể

    4.3.2.2.1.Giai đoạn ủ bệnh: 6-8 tuần kể từ khi virus HIV xâm nhập vào trong cơ thể các phương pháp phát hiện kháng thể đặc hiệu HIV thông thường (Serodia, ELISA, Test nhanh, WB) chưa thể giúp ích gì cho chẩn đoán giai đoạn này gọi là “giai đoạn cửa sổ sinh học’’. Giai đoạn này từ khi nhiễm HIV 1 tuần lễ: một số kỹ thuật có thể giúp ích chẩn đoán như:
    - Phân lập virus.
    - PCR.
    - Phát hiện kháng nguyên p24.
    - Phát hiện kháng thể Ig (kỹ thuật ELISA sandwich)

    4.3.2.2.2. Giai đoạn có kháng thể
    Kỹ thuật:
    - Serodia.
    - ELISA.
    - Test nhanh.
    - Western blot.

    4.3.3. Nhận định kết quả.

    4.3.3.1. Các phương pháp trực tiếp:
    - Dương tính: kết luận dương tính.
    - Âm tính: kết luận âm tính.

    4.3.3.2. Các phương pháp xét nghiệm gián tiếp:
    - Mẫu thử nghiệm âm tính lần đầu: kết luận âm tính.
    - Để khẳng định mẫu HIV dương tính: Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với khi mẫu đó dương tính cả ba lần xét nghiệm bằng ba loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.

    QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM TẠI PHÒNG HIV BỆNH VIỆN PHONG - DA LIỄU TRUNG ƯƠNG QUY HOÀ





    5. Kết luận: Để kết luận tình trạng mẫu thử là dương tính khi:

    5.1. Tính hợp lệ của thử nghiệm:
    Theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất sinh phẩm.

    5.2. Chỉ thực hiện tại các phòng thí nghiệm HIV được phép khẳng định HIV dương tính.

    5.3. Theo đúng hướng dẫn sử dụng sinh phẩm và đúng phương cách xét nghiệm.

    5.4. Nếu kết quả giữa các thử nghiệm không phù hợp, hẹn 3 tháng sau lấy mẫu xét nghiệm lại.

    Tài liệu tham khảo
    1. Phạm nhật An và cs (1995), Nhiễm HIV/AIDS y học cơ sở, lâm sàng và phòng chống, NXBY học, Hà nội, 26-51.
    2. Trần chí Liêm và CS (11-2001), xét nghiệm chẩn đoán HIV, Hà nội, 4-28.
    3. Trương xuân Liên, tài liệu tập huấn tại viên Pasteur TPHCM.

  9. #8
    Admin diendanhiv.vn
    ( Sanh năm 1971 )
    Tuanmecsedec's Avatar
    Ngày tham gia
    29-08-2007
    Giới tính
    Nam
    Đến từ
    Giấy chứng nhận tham vấn số : 041/UB AIDS - TV do ủy ban phòng chống HIV/AIDS TPHCM.
    Bài viết
    74,838
    Cảm ơn
    3,481
    Được cảm ơn: 18,160 lần
    Xét nghiệm HIV là rất cần thiết và ý nghĩa của nó rất quan trọng đối với mỗi người


    Hiện nay, xét nghiệm máu là cách duy nhất để biết được một người có bị nhiễm HIV hay không.

    Xét nghiệm HIV (test HIV) là đi tìm kháng thể kháng virus HIV. Các kháng thể này là một loại protein được cơ thể sản sinh ra để chống lại virus HIV sau khi virus này xâm nhập vào cơ thể.

    Xác định tình trạng nhiễm HIV

    Một số điều các bạn cần quan tâm về xác định tình trạng nhiễm HIV

    Xét nghiệm xác định HIV

    Xét nghiệm Elisa: Là một xét nghiệm nhằm xác định kháng thể kháng HIV có trong huyết thanh của người nhiễm. Xét nghiệm này được trình bày theo cơ chế sau:



    Kháng nguyên HIV được phủ lên trên những hạt nhựa gắn Elisa
    Huyết thanh người có chứa kháng thể (kháng thể thứ nhất). Nếu người nhiễm HIV thì huyết thanh sẽ có kháng thể kháng HIV và kháng thể này sẽ gắn với kháng nguyên HIV đã được gắn trên hạt nhựa
    Kháng immunoglobulin (kháng thể kháng kháng thể người – kháng thể thứ hai) có chứa enzym. Đây là kháng thể thứ hai và nó sẽ gắn với kháng thể kháng HIV nếu kháng thể này hiện diện.
    Chỉ thị màu nếu enzym của (kháng thể thứ hai) hoạt động (gắn vào kháng thể thứ nhất) sẽ làm chuyển màu
    Kết quả: ELISA dương tính
    Có sự gắn kết của kháng thể thứ nhất với kháng nguyên và kháng thể thứ hai với kháng thể thứ nhất
    Elisa âm tính
    Không có sự gắn kết giữa kháng nguyên và kháng thể


    Xét nghiệm Western blot

    Xác định kháng nguyên đặc trưng của virus HIV (đặc thù theo từng cộng đồng theo châu lục)

    Các test nhanh


    Hiện nay có khá nhiều test nhanh để chẩn đoán nhanh về tình trạng nhiễm HIV (Tùy theo từng đơn vị nhập mà các test nhanh này có thể khác nhau).

    Giá trị của xét nghiệm chẩn đoán dương tính của các test này đạt khoảng 99,5%.


  10. #9
    Admin diendanhiv.vn
    ( Sanh năm 1971 )
    Tuanmecsedec's Avatar
    Ngày tham gia
    29-08-2007
    Giới tính
    Nam
    Đến từ
    Giấy chứng nhận tham vấn số : 041/UB AIDS - TV do ủy ban phòng chống HIV/AIDS TPHCM.
    Bài viết
    74,838
    Cảm ơn
    3,481
    Được cảm ơn: 18,160 lần
    CÁC NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM HIV

    Nguyễn Hoàng Ân

    1. Đại cương:
    1.1. Cấu trúc của virus HIV.

    CẤU TRÚC CỦA VIRUS HIV

    HIV có đặc điểm chung của họ retroviridae. Hạt virus hoàn chỉnh (virion) có cấu trúc gồm 3 lớp.

    1.1.1. Lớp vỏ ngoài (vỏ peplon): lớp này là 1 màng lipid kép có kháng nguyên chéo với màng nguyên sinh chất tế bào. Gắn lên màng này là các nhú. Đó là các phân tử Glycoprotein có trọng lượng phân tử 160 kilodalton (gp160). Nó gồm có 2 phần:
    + Glycoprotein màng ngoài có trọng lượng phân töû là 120 kilodalton (gp120). GP120 là kháng nguyên deã biến đổi nhất, gây khó khăn cho phản ứng bảo vệ cơ thể và chế vaccin phòng bệnh.
    + Glycoprotein: xuyên màng có trọng lượng phân töû 41 kilodalton.

    1.1.2. Vỏ trong (vỏ capsid): vỏ này gồm 2 lớp protein:
    + Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi protein có trọng lượng phân töû 18 kilodalton (p18).
    + Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi các phân töû có trọng lượng phân tử là 24 kilodalton (p24). Đây là kháng nguyên rất quang trọng để chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS.

    1.1.3. Lõi:
    Là những thành phần bên trong của vỏ capsid, bao gồm:
    + Hai phân tử ARN đơn, đó là bộ gen di truyền HIV(genom).
    Genom của HIV chứa 3 gen cấu trúc: Gag (group specific antigen) là cac gen mã hoá cho các kháng nguyên đặc hiệu của capsid cuûa virus; Pol (polymerase) mã hoá cho các Enzym: reverve transcriptase (RT:Enzym sao mã ngược), protease và endonuclease (còn gọi kháng nguyên integrase); và EnV (envelop) mã hoá cho glycoprotein lớp vỏ peplon của HIV.

    1.2. Sự xâm nhập vào tế bào và nhân lên của virus HIV.


    1.2.1. Sự hấp phụ lên bề mặt tế bào.
    HIV bám vào bề mặt tế bào cảm thụ nhờ sự phù hợp giữa Receptor tế bào với GP120 của nó. Trong đa số các trường hợp, các receptor này là các phân tử CD4 của lympho T hỗ trợ hoặc một soá tế bào khác như bạch cầu đơn nhân lớn, đại thực bào và 1 số tế bào doøng lympho.

    1.2.2. Sự xâm nhập vào tế bào:
    Sau khi đã bám vào các receptor của tế bào vật chủ , phân tử gp41 của HIV cắm sâu vào màng tế bào. Nhờ đó genom của HIV chui vào bên trong của tế bào. Vì vậy giai đoạn này còn gọi là ‘cắm neo và hoà màng’.

    1.2.3. Sự nhân lên trong tế bào:

    1.2.3.1. Sao mã sớm: nhờ RT, ADN bổ sung của HIV đã được tạo thành (đã được tạo thành) từ khuôn mẫu ARN của nó. Lúc đầu là sản phẩm lai ARN_ADN, sau đó nhờ Enzym ARN_ase tách ARN khỏi ADN và sợi ADN bổ sung mới được tổng hợp, tạo thành phân tử ADN chuỗi kép.


    1.2.3.2. Tích hợp.
    Sau khi tổng hợp ADN kép tạo thành dạng vòng khép kín và chui vào nhân tế bào chủ. Sau đó nó tích hợp vào ADN nhờ integrase .
    Nhờ tích hợp, HIV đã tránh được sự bảo vệ cơ thể, tác dụng của thuốc và gây bệnh chậm.
    Sau khi tích hợp, AND của HIV có toàn tại ở một trong 2 trạng thái:
    - Không hoạt động và nằm im như tiền virus. Trạng thái tiềm tàng này có thể trở thành hoạt động như những virus độc lực dưới các tác động của môi trường.
    - ADN bổ sung của HIV được sao chép thành hạt virion mới. Ñây là trạng thái nhân lên của HIV với các bước tiếp theo như sau:

    1.2.3.3. Sao mã muộn:
    ADN boå sung của HIV được sao mã thành ARN genom và ARN thoâng tin cho nó (mARN)

    1.2.3.4. Dịch mã:
    Nhờ mARN được tạo thành ở giai đoạn trên, các prrotein cần của HIV được toång hợp.

    1.2.3.5. Lắp ráp các hạt virion mới:
    Từ các thành phần đã được toång hợp, các hạt HIV mới được lắp ráp ở bào tương tế bào.

    1.2.3.6. Giải phóng các hạt HIV mới:
    Từ các vị trí lắp ráp các hạt HIV gần màng nguyên sinh chất, các màng này nảy chồi và các hạt HIV được giải phóng. Chúng tiếp tục gây nhiễm cho tế bào mới, còn tế bào đã giúp chúng nhân lên thì bị diệt.

    2. Mục tiêu xét nghiệm HIV.

    2.1. Giám sát HIV/AIDS.

    2.2. An toàn truyền máu.

    2.3. Chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS.

    2.4. Nghiên cứu khoa học.

    3. Các phương cách xét nghiệm HIV.

    3.1. Phương cách I. (áp dụng cho công tác an toàn truyền máu):
    Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách I khi mẫu đó dương tính với một trong các thử nghiệm như: ELISA, Serodia hay thử nghiệm nhanh.
    Trong truyền máu, mẫu máu được xét nghiệm với phương cách I nếu dương tính hay nghi ngờ đều phải loại bỏ.

    3.2. Phương cách II: (áp dụng cho giám sát trọng điểm):
    Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách II khi mẫu đó dương tính cả hai lần xét nghiệm bằng hai loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.

    3.3. Phương cách III: (chẩn đoán nhiễm HIV).
    Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách III khi mẫu đó dương tính cả ba lần xét nghiệm bằng ba loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.

    4. Các nguyên lý và phương pháp xét nghiệm HIV.

    4.1. Phương pháp gián tiếp:
    Phát hiện kháng thể kháng HIV trong máu, dịch tiết.
    Áp dụng:
    - Giám sát dịch tễ.
    - Chẩn đoán nhiễm HIV trên 18 tháng tuổi.
    Các kỹ thuật tìm kháng thể được chia thành 2 loại:
    * Các xét nghiệm phát hiện sàng lọc: cần có độ nhạy cao.
    * Các xét nghiệm khẳng định: cần độ đặc hiệu cao.

    4.1.1. Xét nghiệm phát hiện sàng lọc.

    Các kỹ thuật: ELISA, các thử nghiệm nhanh có độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau. Phối hợp các kỹ thuật khác nhau trong các phương cách xét nghiệm phải tuân theo nguyên tắc:
    * Thử nghiệm đầu tiên có độ nhạy cao.
    * Các thử nghiệm tiếp theo có nguyên lý hoặc cách chuẩn bị KN khác nhau và cần có độ đặc hiệu cao.

    4.1.1.1. Thử nghiệm miễn dịch gắn men – Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
    * Nguyên lý chung:
    - Kháng nguyên (Ag) virus cố định trên phiến nhựa.
    - Kháng thể (Ab) kháng HIV của bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với Ag.
    - Phức hợp Ag-Ab được phát hiện bởi hệ thống cộng hợp gắn enzyme và cho phản ứng hiện màu với cơ chất tương ứng.

    4.1.1.1.1. ELISA gián tiếp: Độ nhạy cao huyết thanh cần thử ủ với bản nhựa đã gắn kháng nguyên, sau khi rửa để loại kháng thể thừa, không đặc hiệu, lại tiếp tục ủ với kháng thể kháng globulinngười gắn Enzym. Hoạt tính Enzym sẽ biến cơ chất không màu thành một sản phẩm có màu. Phản ứng màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường và đọc chính xác bằng quang kế.


    Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể


    4.1.1.1.2. ELISA sandwich: độ đặc hiệu và độ nhạy cao.
    Cũng tương tự kỷ thuật ELISA gián tiếp chỉ khác là kháng nguyên virus có gắn Enzym được thay kháng thể globlin người gắn enzym. Như vậy hình thành 1 Sandwich của phức hợp KN_KT_KN_Enzym. Sự thay đổi này làm tăng độ nhạy và đô đặc hiệu của phản ứng, nó cũng cho cho phép phát hiện tất cả các lớp kháng thể vì không dùng Anti IgG người gắn Enzym.


    Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể


    Ví dụ:

    4.1.1.1.3. ELISA cạnh tranh: Độ nhạy cao.
    Nguyên lý phản ứng tương tự như hai loại trên song chỉ khác là huyết thanh của mẫu thử có KT kháng HIV ủ cùng với kháng thể kháng HIV có gắn Enzym. Như vậy có sự tranh chấp giữa hai loại kháng thể trong phản ứng kết hợp với KN-KT đã gắn vào pha rắn, Đậm độ KT trong mẫu thử càng cao thì KT càng ít được cố định vào KN . Cơ chất sẽ cho 1 phản ứng màu tỉ lệ nghịch với đâm đô KT của màu phải thử.

    ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH GẮN MEN – ELISA.

    * Ưu điểm:
    - Thực hiện đồng thời được nhiều mẫu.
    - Đọc kết quả bằng máy không phụ thuộc vào chủ quan của con người.
    - Có thể lưu kết quả, thuận lợi cho kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm.
    - Giá thành tương đối rẻ.

    * Hạn chế:
    - Phải đầu tư trang thiết bị ban đầu và bảo dưỡng máy.
    - Sinh phẩm phải bảo quản lạnh.
    - Nhân viên xét nghiệm phải được đào tạo.
    - Thời gian thực hiện: 3 – 4 giờ.
    - Nếu số lượng mẫu ít thì tốn kém vì phải làm nhiều chứng.

    4.1.1.2. Các thử nghiệm nhanh.

    4.1.1.2.1. Thử nghiệm ngưng kết hạt Serodia:
    - Nguyên lý:
    Những hạt gelatin được gắn với các thành phần KN của virus HIV sẽ tạo ngưng kết khi trong huyết thanh (hoặc huyết tương) bệnh nhân có KT kháng HIV.
    - Kháng nguyên được gắn trên hạt gelatin:
    HIV 1 gp41 protein tái tổ hợp.
    HIV 1 p24 protein tái tổ hợp.
    HIV2 gp36 protein tái tổ hợp.


    4.1.1.2.2. Các thử nghiệm nhanh:
    - Kit Determine HIV1/2: dựa trên nguyên lý miễn dịch sắc ký. (Thường sử dụng để kiểm tra HIV gấp và luôn phải được kiểm chứng bằng kỹ thuật khác)
    - Kit Multispot HIV1/2: là phương pháp miễn dịch trên màng lọc, dựa trên nguyên lý ELISA (Phân biệt được HIV1 và HIV2).


    * Ưu điểm:
    - Xét nghiệm với số lượng mẫu nhỏ.
    - Dễ thực hiện, cho kết quả nhanh.
    - Không đòi hỏi thiết bị đặc biệt, sinh phẩm dễ bảo quản.
    - Có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở.
    - Xét nghiệm viên có thể được đào tạo nhanh.

    * Nhược điểm:
    - Giá thành cao.
    - Không thuận lợi khi xét nghiệm số mẫu lớn.
    - Không lưu được dữ liệu kỹ thuật.
    - Một số test nhanh có độ nhạy kém hơn so với ELISA.

    4.1.2. Xét nghiệm khẳng định.
    Western blot (Kit New Lab blot I ):

    4.1.2.1. Nguyên lý:
    - Protein Virus HIV được tách theo PM bằng điện di trên gel polyacrylamid.
    - Chuyển sang giấy nitrocellulose, các protein định vị theo PM.
    - KT kháng HIV trong mẫu thử kết hợp đặc hiệu với KN tương ứng.
    - Phát hiện phức hợp KN-KT bằng cộng hợp KT kháng IgG gắn men, cho phản ứng màu với cơ chất tại các vị trí có KT đặc hiệu với KN tương ứng. Western blot có độ nhạy và độ đặc hiệu cao; song giá thành cao và đòi hỏi người xét nghiệm phải có trình độ và kinh nghiệm.


    4.1.2.2. Biện luận kết quả.
    * WB âm tính: không có băng nào
    * WB dương tính: có ít nhất 2 băng tương ứng với proteine vỏ:
    HIV 1: gp 160, gp 120, gp 41
    HIV 2: gp 140, gp 125, gp 36 ngoài ra có các băng tương ứng với sản phẩm của gen gag/pol.
    * WB chưa xác định : có băng ở vị trí khác tiêu chuẩn WB dương tính.

    4.2. Phương pháp trực tiếp:
    Phát hiện trực tiếp: KN virus, axit nucleic hoặcVirus.
    Áp dụng:
    - Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV.
    - Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện KT không rõ ràng.
    - Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virút và trong các mục đích nghiên cứu khác.

    4.2.1. Phân lập virus bằng nuôi cấy tế bào.
    Nguyên lý:
    - Tách tế bào đơn nhân trong máu bệnh nhân và nuôi cấy chung với tế bào đơn nhân của người lành đã được hoạt hóa trong môi trường nuôi cấy PHA (phytohemagglutinin) thích hợp.
    - Xác định sự nhân lên của virus bằng kỹ thuật:
    * ELISA phát hiện KN p24 trong nước nổi môi trường nuôi cấy tế bào.
    * Dùng đồng vị phóng xạ phát hiện enzyme sao chép ngược của virus (RT).

    4.2.2. Phát hiện các axit nucleic (RNA) của virus hoặc DNA (provirut) trong tế bào nhiễm.
    * RNA của virus HIV bằng kỹ thuật RT-PCR:
    • RNA enzyme sao chép ngược và mồi cDNA
    • Quá trình PCR là chuỗi nhiều chu kỳ kế tiếp nhau.

    Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
    - Bước 1: biến tính tách rời 2 chuỗi của phân tử DNA đích ở nhiệt độ 940 – 950.
    - Bước 2: bắt cặp, các cặp mồi đặc hiệu cho một trình tự DNA xác định bắt cặp với sợi DNA đích ở nhiệt độ 400 -700.
    - Bước 3: tổng hợp, kéo dài. Ở nhiệt độ 720, Taq polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA có trình tự bổ sung cho sợi khuôn.

    - Trong chẩn đoán nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh, ngoài RT- PCR còn dùng PCR phát hiện các DNA provirút trong tế bào nhiễm.
    - PCR được thực hiện trên 3 vùng gen: env, gag và pol.
    - Kết quả được trả lời dương tính khi có PCR dương tính ít nhất là trên hai trong ba gen và được thực hiện trên hai mẫu máu ở thời điểm khác nhau.

    * Ưu điểm: có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh chóng.
    * Hạn chế: phải có cơ sở phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn và trang thiết bị đắt tiền. Cán bộ cần đào tạo tốt.





    4.2.3. Phát hiện KN p24 của virus trong máu.
    - p24 là một chỉ số trực tiếp phản ánh sự nhân lên của virut
    - Được phát hiện sớm trong giai đoạn mới nhiễm.
    - Giảm khi có KT kháng p24.
    - Gia tăng khi chuyển sang giai đoạn AIDS

    Kit phát hiện p24: ELISA sandwich.
    * Nguyên lý:
    KT đơn dòng kháng với KN p24 được gắn sẵn trong các giếng, nếu mẫu thử có KN p24 sẽ gắn với KT này và được phát hiện bằng cộng hợp (KT đa dòng kháng HIV) gắn men cho phản ứng màu với cơ chất.

    4.3. Lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm HIV.

    4.3.1. Sự biến động của các thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm HIV chưa điều trị.
    - Kháng nguyên HIV đặc hiệu KNp24 xuất hiện sớm, một thời gian ngắn sau nhiễm HIV và duy trì trong suốt thời gian cấp (sớm) của nhiễm HIV. Sau đó KNp24 giảm dần đồng thời có sự xuất hiện KTp24. Điều này báo hiệu giai đoạn không triệu chứng của nhiễm HIV.
    - Vài tháng tới vài năm sau nhiễm trùng, KTp24 mất đi v KNp24 tái xuất hiện, báo giai đoạn triệu chứng của bệnh. Sự nhân lên của HIV tương ứng với sự có mặt của KNp24.
    - Kháng thể HIV: Trước tiên kháng thể HIV lớp IgM xuất hiện, sau đó giảm dần và thay vào đó là KT lớp IgG. IgG khng p24 xuất hiện và giảm dần cùng với sự mất đi và xuất hiện lại KN HIV. Trong khi đó IgG kháng KN vỏ của HIV tồn tại lâu dài trong suốt thời gian bị nhiễm.


    4.3.2. Lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm HIV

    4.3.2.1. Nguyên tắc chung.
    - Mục đích xét nghiệm.
    - Thời điểm phơi nhiễm.
    - Đối tượng xét nghiệm.
    - Tỷ lệ nhiễm trong quần thể.
    - Thời gian cần trả lời kết quả.
    - Điều kiện cụ thể của phòng thí nghiệm.
    - Tư vấn trước xét nghiệm.

    4.3.2.2. Lựa chọn cụ thể

    4.3.2.2.1. Giai đoạn ủ bệnh: 6-8 tuần kể từ khi virus HIV xâm nhập vào trong cơ thể các phương pháp phát hiện kháng thể đặc hiệu HIV thông thường (Serodia, ELISA, Test nhanh, WB) chưa thể giúp ích gì cho chẩn đoán giai đoạn này gọi là “giai đoạn cửa sổ sinh học’’. Giai đoạn này từ khi nhiễm HIV 1 tuần lễ: một số kỹ thuật có thể giúp ích chẩn đoán như:
    - Phân lập virus.
    - PCR.
    - Phát hiện kháng nguyên p24.
    - Phát hiện kháng thể Ig (kỹ thuật ELISA sandwich)

    4.3.2.2.2. Giai đoạn có kháng thể
    Kỹ thuật:
    - Serodia.
    - ELISA.
    - Test nhanh.
    - Western blot.

    4.3.3. Nhận định kết quả.

    4.3.3.1. Các phương pháp trực tiếp:
    - Dương tính: kết luận dương tính.
    - Âm tính: kết luận âm tính.

    4.3.3.2. Các phương pháp xét nghiệm gián tiếp:
    - Mẫu thử nghiệm âm tính lần đầu: kết luận âm tính.
    - Để khẳng định mẫu HIV dương tính: Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với khi mẫu đó dương tính cả ba lần xét nghiệm bằng ba loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.

    QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM TẠI PHÒNG HIV BỆNH VIỆN PHONG - DA LIỄU TRUNG ƯƠNG QUY HOÀ



    5. Kết luận: Để kết luận tình trạng mẫu thử là dương tính khi:

    5.1. Tính hợp lệ của thử nghiệm:
    Theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất sinh phẩm.

    5.2. Chỉ thực hiện tại các phòng thí nghiệm HIV được phép khẳng định HIV dương tính.

    5.3. Theo đúng hướng dẫn sử dụng sinh phẩm và đúng phương cách xét nghiệm.

    5.4. Nếu kết quả giữa các thử nghiệm không phù hợp, hẹn 3 tháng sau lấy mẫu xét nghiệm lại.

    Tài liệu tham khảo
    1. Phạm nhật An và cs (1995), Nhiễm HIV/AIDS y học cơ sở, lâm sàng và phòng chống, NXBY học, Hà nội, 26-51.
    2. Trần chí Liêm và CS (11-2001), xét nghiệm chẩn đoán HIV, Hà nội, 4-28.
    3. Trương xuân Liên, tài liệu tập huấn tại viên Pasteur TPHCM.

  11. #10
    Thành viên chính thức
    Ngày tham gia
    21-11-2013
    Giới tính
    Nam
    Đến từ
    TP.Hồ Chí Minh
    Bài viết
    430
    Cảm ơn
    2
    Được cảm ơn: 145 lần

    Xét nghiệm miễn dịch điện hóa phát quang

    Đây là loại XN có độ nhậy cao theo nguyên lý điện hóa miễn dịch (độ nhậy cao hơn ELISA).Nguyên lý: Kỹ thuật điện hóa phát quang (ECL: Electrode Chemi Luminescence) sử dụng chất đánh dấu Ruthenium khởi phát từ điện chứ không phải từ phản ứng hóa học, vì vậy có khả năng phát hiện chất có nồng độ thấp và cho kết quả rất nhanh chỉ trong vòng 18 – 20 phút. Các kháng thể (hoặc kháng nguyên) gắn biotin và chất đánh dấu ruthenium cùng vi hạt phủ streptavidin được ủ trong hỗn hợp phản ứng. Khi đặt một điện thế lên điện cực buồng đo, phức hợp ruthenium được kích hoạt và tín hiệu phát quang được hình thành. Tín hiệu được đo và kết quả xét nghiệm được xác định qua đường chuẩn xét nghiệm đã được thiết lập.

Thông tin về chủ đề này

Users Browsing this Thread

Có 1 người đang xem chủ đề. (0 thành viên và 1 khách)

Các Chủ đề tương tự

  1. Anh Tanmecsedec cho hỏi xét nghiệm combi ag/ab (ECLIA) có khác gì pp elisa không anh
    Bởi lamlo922 trong diễn đàn Hỏi Và Đáp : Xét nghiệm HIV
    Trả lời: 62
    Bài viết cuối: 09-06-2014, 11:01
  2. Phương pháp xét nghiệm nào tốt? Tản mạn về HIV testing (cập nhật 8/2010)
    Bởi SmileAndLive trong diễn đàn Hỏi Và Đáp : Xét nghiệm HIV
    Trả lời: 15
    Bài viết cuối: 10-03-2014, 16:52
  3. 9 tuần xét nghiệm bằng phương pháp detemire 1/2 âm tính thì tin k anh chi ơi huhu
    Bởi Xinchoemmotloikhuyen trong diễn đàn Hỏi Và Đáp : Xét nghiệm HIV
    Trả lời: 18
    Bài viết cuối: 09-08-2013, 16:48
  4. 10 đột phá mới về phương pháp chữa HIV.
    Bởi Tuanmecsedec trong diễn đàn Thông tin về HIV
    Trả lời: 0
    Bài viết cuối: 09-07-2013, 10:30

Tag của Chủ đề này

Quyền viết bài

  • Bạn Không thể gửi Chủ đề mới
  • Bạn Không thể Gửi trả lời
  • Bạn Không thể Gửi file đính kèm
  • Bạn Không thể Sửa bài viết của mình
  •